李靜 張欣欣

肝臟疾病是嚴重危害人類健康的常見病，已成為人類面臨的公共衛(wèi)生問題之一。目前，肝臟穿刺活檢術被認為是多種肝臟疾病診斷的“金標準”，由于受取樣誤差影響，其作為一種侵入性檢查手段具有一定局限性。對于檢測血液標志物和多種影像學檢查等非侵入性方法，雖具較高診療價值，但相對缺乏敏感性和特異性。因此，尋找一種針對肝臟疾病早期、非侵入性的診療方法具有重要意義。

近年來，液體活檢作為“精準醫(yī)學”無創(chuàng)診療的發(fā)展方向之一，可以通過患者的血液或者其他體液樣本(尿液、胸腔積液等)獲取相關疾病信息，具有非侵入性、可重復性、樣本均質、樣本抽取方便等優(yōu)點。目前監(jiān)測肝臟疾病的液體活檢指標主要有血漿中的細胞外囊泡、循環(huán)游離DNA、游離非編碼RNA和循環(huán)腫瘤細胞[1]，常應用于疾病的早期診斷、評價轉移風險、指導研發(fā)新的靶向藥物及制定個體化治療方案等方面。

一、細胞外囊泡(EVs)

EVs是細胞釋放到細胞外環(huán)境中的膜結合小泡，根據(jù)直徑和分泌方式的不同分為外泌體和微粒(MPs)。外泌體為直徑30～100 nm的膜性微囊泡，是細胞膜向內突出形成的多囊內體，與細胞膜融合后將外泌體釋放到胞外。MPs是直徑為100～1000 nm的小囊泡，當細胞受到刺激時，細胞膜通過外排作用釋放MPs到細胞外。肝臟中的肝細胞、竇狀內皮細胞、肝星狀細胞、匯管區(qū)成纖維細胞和膽管細胞均可產生EVs，其攜帶著來源細胞的特異性蛋白和RNA等生物分子穩(wěn)定存在于體液中，因此EVs表面的標記物或其攜帶的蛋白質、脂質、RNA等成分可以作為液體活檢的新型指標。

有研究利用熒光激活細胞分選技術在非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)患者、慢性丙型肝炎(CHC)患者和健康志愿者血液中檢測MPs的白細胞-內皮細胞表面標志物，結果發(fā)現(xiàn)相比CHC患者和健康人，NAFLD患者單核細胞和自然殺傷T細胞分泌MPs水平增加，而中性粒細胞和白細胞-內皮細胞分泌MPs水平下降。利用類似的表面標志物，Rautou等分析了繼發(fā)于CHC和酒精性肝病(ALD)肝硬化患者的血液MPs水平，發(fā)現(xiàn)肝硬化患者的MPs水平高于正常人水平，且隨著Child-Pugh評分的增高而增高。

除了分析EVs表面標志物外，還可以分析其攜帶的蛋白質和RNA。非酒精性脂肪性肝炎(NASH)/NAFLD小鼠模型和NASH患者中的EVs均被證實含有特殊的抗原成分。Arbelaiz等分析原發(fā)性硬化性膽管炎(PSC)、膽管上皮癌(CCA)、肝細胞癌(HCC)和正常人4組血液EVs的蛋白質組學，發(fā)現(xiàn)了多種特異性差異蛋白，由此獲得了接近現(xiàn)有腫瘤指標的受試者曲線下面積(AUC)。對于EVs攜帶的RNA，尤其是miRNAs，通過分析其濃度及包裝差異逐步成為鑒別診斷的依據(jù)之一。如健康人群肝臟細胞分泌的miR-122主要與Ago2結合，在ALD小鼠模型中，肝臟細胞分泌的miR-122存在于EVs中，在對乙酰氨基酚誘導的肝損害模型中以與蛋白質結合的形式存在，而在NAFLD患者血清中，大多數(shù)的miR-122獨立存在，且隨著時間進展和肝組織的嚴重程度加重而增多。

二、循環(huán)游離DNA(cfDNA)

cfDNA是一種存在于外周血及體液中的游離DNA，由細胞凋亡或壞死后釋放產生，平均長度約180個堿基對(bp)。以往研究表明惡性腫瘤患者外周血cfDNA明顯高于健康者，但近期發(fā)現(xiàn)包括自身免疫性疾病在內的某種情況下cfDNA也會增高，由此針對cfDNA表觀遺傳學改變逐漸受到重視，如cfDNA甲基化?，F(xiàn)有研究通過大數(shù)據(jù)分析cfDNA甲基化構建出了一種分類器，能夠識別血液樣本中癌癥來源的DNA并確定其屬于哪種癌癥類型[2]。

多個研究表明GSTP1 cfDNA的高甲基化對于診斷肝癌有較高的特異性(70%～91%)和敏感性(50%～75%)。RASSF1A cfDNA的高甲基化與腫瘤的大小正相關，而LINE-1 cfDNA 的低甲基化代表著腫瘤的進展和預后較差，把兩者的甲基化狀態(tài)結合起來可以預測肝癌術后的復發(fā)情況。一項納入1098位HCC患者和835位健康志愿者的研究，成功篩選出了10個cfDNA甲基化的標志物用于HCC的靈敏診斷，敏感度和特異度分別為83.3和90.5%，AUC為0.966。通過檢測cfDNA異常甲基化的方法可以比現(xiàn)有HCC診斷標準提前9年。在肝癌術后患者尿液中，檢測cfDNA甲基化狀態(tài)可比核磁共振提前9個月監(jiān)測到肝癌復發(fā)。因此cfDNA甲基化對于腫瘤的早期診斷及預后評估等有重要作用。但是，對于cfDNA的提取、擴增，甲基化的測定都有較高的要求。此外，作為cfDNA的特殊類型，循環(huán)腫瘤細胞DNA(ctDNA)所攜帶的DNA片段序列可代表整體腫瘤的突變特征，通過測序分析突變情況，可用于不同藥物耐藥機制研究和指導個體化治療。

Hardy等納入了26例經肝臟穿刺活檢證實的NAFLD患者，發(fā)現(xiàn)血漿cfDNA中過氧化酶增殖因子活化受體γ(PPARγ)基因啟動子DNA甲基化水平與肝臟纖維化的程度具有相關性，因此可以利用血漿PPARγ DNA甲基化的變化來評價NAFLD纖維化的程度，該團隊又進一步在HBV、ALD隊列中進行驗證，證明其高甲基化狀態(tài)特異性地反映肝臟的病理過程。

三、游離非編碼RNA

非編碼RNA分為長鏈非編碼RNA(lncRNA)和短鏈非編碼RNA。lncRNA的長度通常大于200個bp，是非編碼RNA的主要類型。在HCC患者血液中至少有10種lncRNA可供檢測，其中MALAT1和lncSPRY4-1T1隨著肝癌進展而逐漸升高，隨著肝癌術后而降低。通過監(jiān)測血漿中LINC00152、XLOC014172和RP11-160H22.5水平可以從慢性肝炎、肝硬化患者中早期診斷肝癌，如果聯(lián)合甲胎蛋白(AFP)，AUC可分別達到0.986和0.985。但是由于lncRNA的收集、處理和定量仍有難度，lncRNA在其他肝臟疾病中的作用還未完全確定。

短鏈RNA中，特別是微小RNA(miRNA)已被多個研究證實對于診斷HCC具有潛在應用價值，尤其是HCC的早期診斷。以往研究發(fā)現(xiàn)循環(huán)miR-21、miR-26a、miR-27a、miR-122、miR-192、miR-223和miR-801可以區(qū)分HCC與HBV感染者、肝硬化和健康志愿者。而基于24項miRNA研究的META分析篩選出miR-21、miR-122和miR-199是診斷肝癌最具有特異性的指標。一項最新的研究采用了數(shù)字微滴式PCR和RNA測序技術，證實聯(lián)合血漿中miR-101-3p、miR-106b-3p和miR-1246三者的水平變化對于診斷HCC具有最高的診斷價值。

Zekri等發(fā)現(xiàn)在健康人群中cf-miR-29b、cf-miR-122b、cf-miR-885-5p聯(lián)合AFP可以篩選出早期肝癌(AUC=1)，在肝硬化患者中聯(lián)合cf-miR-22、cf-miR-122、cf-miR-221、cf-miR-885-5p和AFP可篩選出早期肝癌(AUC=0.982)。Okajima等報道，血漿中miR-224的水平與肝癌腫瘤大小相關，可以利用cf-miR-224的變化檢測到直徑小于18mm的小肝癌。

相比HCC，關于cf-miRNA在其他肝病的研究正在起步，目前大多數(shù)研究針對HBV和HCV,少數(shù)針對NAFLD和ALD，不同病因之間存在miRNA改變的交叉。有研究指出可以通過cf-miRNA的水平變化來評價疾病的分級，例如，聯(lián)合cf-miR-122水平和血清紫藤凝集素陽性Mac-2結合蛋白檢測進展期HBV相關肝纖維化，其敏感率、特異率和準確率分別為47%、97%和74%。

四、循環(huán)腫瘤細胞(CTCs)

CTCs是指從原發(fā)性腫瘤病灶脫落并侵入外周血循環(huán)的具有高度侵襲性的腫瘤細胞，大部分CTCs在機體的作用下發(fā)生凋亡，只有極少部分留存于外周血中，并逐步進行癌細胞轉移。Zhang等利用微流體芯片技術從36位HCC患者中捕獲并3D培養(yǎng)CTCs，用于探索個體對于索拉菲尼和奧沙利鉑的敏感性。通過腫瘤特異性抗原與相應抗體磁珠結合的方法，可將CTCs從血漿中捕獲并計數(shù)，此種方法已在乳腺癌、前列腺癌和結直腸癌中得到應用。雖然通過此方法篩選出的CTCs特異性高，但是其依賴于腫瘤表面的上皮細胞黏附分子(EpCAM)，而僅有1/3的肝癌患者EpCAM表達陽性，因此也可能導致假陰性。

有些學者提出增加肝癌特異性表達的去唾液酸糖蛋白受體(ASGPR)和氨基甲酰磷酸合成酶1(CPS1)作為多分子聯(lián)合標記提高HCC診斷的特異度和敏感度。Zhou等發(fā)現(xiàn)EpCAM (mRNA+)CTCs的升高聯(lián)合循環(huán)CD4+調節(jié)性T細胞的升高預示著預后較差且容易復發(fā)。新一代的微流體芯片技術CTC-iChip 不依賴于EpCAM對細胞的選擇，具有更高的捕獲CTC的能力，且能夠進行包括單個細胞信號轉導通路在內的各種分子層面的研究[3]，但目前尚未報道應用于HCC。

肝癌細胞要實現(xiàn)循環(huán)系統(tǒng)的侵襲播散，必須發(fā)生細胞表型的轉化，腫瘤細胞上皮-間葉轉化(EMT)被認為是腫瘤細胞血循環(huán)侵襲轉移關鍵步驟。Sun等分析比較了肝癌患者外周靜脈血、動脈血、肝下腔靜脈、門靜脈和肝靜脈CTCs的上皮和間質表型，結果發(fā)現(xiàn)肝靜脈中的CTCs數(shù)量最多，不同類型血管之間CTC的EMT狀態(tài)存在異質性，其中大部分CTCs上皮型在經過肝靜脈時成為間質型獲得擴散轉移的能力進入血液循環(huán)。隨訪研究表明在肝靜脈和外周靜脈血中檢測到CTCs和循環(huán)腫瘤栓子分別預示著HCC術后肺轉移和肝內復發(fā)。相較于檢測CTCs數(shù)量的花費較高而無法推廣使用，分析CTCs 表型特征具有較高的臨床實用性。

另外，CTCs的單細胞極性是腫瘤細胞的固有特征，影響著細胞黏附、遷徙和轉移的過程，因此調控CTCs的單細胞極性可成為潛在的治療策略。有研究發(fā)現(xiàn)Talin1的表達有助于CTCs黏附于肝臟內皮細胞并加快轉移速度，通過抑制Talin1的表達也可能成為新的治療靶點。

綜上所述，液體活檢作為無創(chuàng)的檢測手段，血漿中的EVs、cfDNA、游離非編碼RNA和CTCs可實時動態(tài)監(jiān)測患者的病程，為臨床肝臟疾病，特別是HCC的診斷、疾病分期、療效評價、預測預后、耐藥檢測及個體化診療提供了新的途徑。但液體活檢由于技術成本高，再加上缺乏統(tǒng)一規(guī)范的標準，真正用于臨床還有較長的路要走。隨著檢測技術的提升，檢測速度的加快，液體活檢技術可以加速向臨床發(fā)展，架起通向精準醫(yī)療的橋梁。