欒慶祥，金曉峰，黃 鑫，楊 強(qiáng)，錢(qián)莘莘

(貴州省獸藥飼料監(jiān)察所，貴州貴陽(yáng) 550003)

龍膽為龍膽科植物條葉龍膽、龍膽、三花龍膽或滇龍膽的干燥根和根莖，是我國(guó)傳統(tǒng)藥材之一，具有清熱燥濕、瀉肝膽火的功效[1]。近年來(lái)，隨著現(xiàn)代中藥的發(fā)展，從龍膽中發(fā)現(xiàn)的化學(xué)成分已多達(dá)60余種，其多種成分具有一定的藥理活性作用[2-4]，研究表明龍膽苦苷為其主要活性成分，具有保肝、利膽、健胃、抗炎、抗菌等活性[5-8]，是評(píng)價(jià)龍膽質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的首要指標(biāo)[9]，并且在《中國(guó)獸藥典》2015年版中，龍膽苦苷作為中藥龍膽和其制劑龍膽瀉肝散質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制的目標(biāo)成分[10]。

龍膽酊是龍膽經(jīng)加工制成的酊劑，具有健胃的功效，用于治療家畜食欲不振[11]?！吨袊?guó)獸藥典》2015年版收載了該藥，但對(duì)該藥主要活性成分龍膽苦苷含量測(cè)定的方法沒(méi)有收載，為了彌補(bǔ)該標(biāo)準(zhǔn)的這一欠缺，筆者對(duì)中藥龍膽酊主要活性成分龍膽苦苷的含量測(cè)定進(jìn)行方法研究，建立中藥龍膽酊中龍膽苦苷的含量測(cè)定方法，以期為完善中藥龍膽酊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供方法和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1儀器Agilent 1260高效液相色譜儀，配四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、紫外檢測(cè)器等(美國(guó)Agilent公司)；Waters 2695高效液相色譜儀，配四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、紫外檢測(cè)器等(美國(guó)Waters公司)；ZORBAX SB-C18(4.6 mm× 250 mm，5 μm)色譜柱和XDB-C18(4.6 mm× 250 mm，5 μm)色譜柱(美國(guó)Agilent公司)；XS105型和ME802E型電子天平(瑞士Mettler公司)；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2材料與試劑龍膽苦苷對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)110770-201013)；龍膽酊樣品(四川省川龍動(dòng)科藥業(yè)有限公司提供，批號(hào)20130601-1、20130601-2、20130601-3；四川維爾康動(dòng)物藥業(yè)有限公司提供，批號(hào)20131201、20131202、20131203)；甲醇為色譜純；乙醇、磷酸為分析純；試驗(yàn)用水為超純水。

1.3方法

1.3.1色譜條件。流動(dòng)相為甲醇-0.2%磷酸溶液(20∶80，V/V)；柱溫30 ℃；流速1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm；進(jìn)樣量10 μL。

1.3.2對(duì)照品溶液的制備和標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。精密稱取龍膽苦苷對(duì)照品適量，以甲醇為溶劑，配制成龍膽苦苷對(duì)照品溶液濃度為8 mg/mL。取濃度為8 mg/mL的龍膽苦苷對(duì)照品儲(chǔ)備液，用倍比稀釋法配制成系列質(zhì)量濃度的溶液，分別為20、40、80、120、200和320 μg/mL，進(jìn)樣10 μL，測(cè)定龍膽苦苷峰面積。以龍膽苦苷質(zhì)量濃度(C)為橫坐標(biāo)、相應(yīng)峰面積(A)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3供試品溶液的制備。精密量取本品1 mL，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，密塞，稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率50 kHz)20 min，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液過(guò)0.45 μm微孔濾膜，即得。

1.3.4陰性樣品溶液的制備。精密量取40%的乙醇1 mL，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，密塞，稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率50 kHz)20 min，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液過(guò)0.45 μm微孔濾膜，即得。

1.3.5自制樣品溶液的制備。按《中國(guó)獸藥典》中龍膽酊的制法，制得龍膽酊，然后精密量取1 mL自制樣品，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，密塞，稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率50 kHz)20 min，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液過(guò)0.45 μm微孔濾膜，即得。

1.3.6系統(tǒng)適用性和專屬性試驗(yàn)。分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液10 μL注入高效液相色譜儀，按“1.3.1”色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖，考察系統(tǒng)適應(yīng)性。

1.3.7加樣回收率試驗(yàn)。采用加標(biāo)回收的方法，在已知含量的龍膽酊供試品中加入一定質(zhì)量的龍膽苦苷對(duì)照品，使其制備后在供試品中加入龍膽苦苷的量為其含量的100%，平行制備6份。再按照“1.3.1”色譜條件測(cè)定峰面積，根據(jù)擬合的曲線方程外標(biāo)法定量，計(jì)算出樣品中龍膽苦苷的測(cè)定量，加樣回收率=(測(cè)定量-已知量)/添加量×100%。取已知龍膽苦苷含量的龍膽酊樣品(批號(hào)20130601-1，含量為2.090 μg/mL)，平行量取樣品6份，每份精密量取樣品1 mL，并分別精密加入100%樣品含量的龍膽苦苷對(duì)照品，按“1.3.3”方法制備供試品溶液，精密吸取10 μL上機(jī)測(cè)定。

1.3.8精密度試驗(yàn)。取供試品(批號(hào)20130601-1)溶液，精密吸取10 μL，按“1.3.1”色譜條件進(jìn)樣，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定龍膽苦苷的峰面積及其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。

1.3.9耐用性試驗(yàn)。取“1.3.7”項(xiàng)下制備好的樣品，保持流動(dòng)相比例和流速不變，在Waters 2695和Agilent 1260高效液相色譜儀上分別使用Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm× 250 mm，5 μm)色譜柱和Agilent XDB-C18(4.6 mm× 250 mm，5 μm)色譜柱，于20、30、40 ℃條件下進(jìn)行測(cè)試，考察方法的耐用性。

1.3.10穩(wěn)定性試驗(yàn)。取同一對(duì)照品溶液，于制備后0、2、4、6、12、24 h注入液相色譜儀，按“1.3.1”色譜條件分別進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜峰面積，計(jì)算RSD。

1.3.11樣品測(cè)定。取不同批號(hào)的龍膽酊樣品和自制龍膽酊樣品，分別按“1.3.3”方法制備供試品溶液，精密吸取10 μL上機(jī)測(cè)定峰面積，根據(jù)擬合的曲線方程外標(biāo)法定量，計(jì)算出樣品中龍膽苦苷的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1系統(tǒng)適用性和專屬性試驗(yàn)從圖1可以看出，龍膽苦苷峰分離度大于2.0，理論塔板數(shù)以龍膽苦苷峰計(jì)不低于要求的3 000，陰性樣品在與對(duì)照品和供試品色譜峰相同保留時(shí)間處無(wú)干擾峰。結(jié)果表明，處方中的其他成分對(duì)龍膽苦苷的定量測(cè)定無(wú)干擾，專屬性能滿足檢測(cè)要求。

圖1 對(duì)照品(a)、供試品(b)和陰性樣品(c)的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of reference substance(a)，testing sample(b)and negative sample(c)

2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制以龍膽苦苷質(zhì)量濃度(C)為橫坐標(biāo)、相應(yīng)峰面積(A)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得出龍膽苦苷的回歸方程為A=11.5C-4.24(r=0.999 9)，表明龍膽苦苷在20～320 μg/mL線性關(guān)系良好。

2.3加樣回收率試驗(yàn)從表1可以看出，龍膽苦苷回收率為95.6%～97.3%，平均回收率為96.4%，RSD為0.63%，表明該方法準(zhǔn)確、可靠，可用于龍膽酊中龍膽苦苷的含量測(cè)定。

表1 龍膽苦苷加樣回收率試驗(yàn)

2.4精密度試驗(yàn)按照“1.3.8”方法操作，測(cè)定出龍膽苦苷的峰面積分別為472.46、472.38、471.77、471.46、471.60、471.48，其RSD為0.10%，表明儀器精密度良好。

2.5耐用性試驗(yàn)按照“1.3.9”方法操作，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該方法能夠耐受不同液相色譜儀、色譜柱、柱溫等因素的小范圍變化，測(cè)定龍膽酊中龍膽苦苷的含量無(wú)顯著差異，說(shuō)明耐用性良好。

2.6穩(wěn)定性試驗(yàn)按照“1.3.10”方法操作，計(jì)算得出龍膽苦苷峰面積分別為472.46、471.60、472.67、473.40、478.53、472.11，RSD為0.54%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7樣品測(cè)定按照“1.3.11”方法操作，結(jié)果發(fā)現(xiàn)20130601-1、20130601-2、20130601-3、20131201、20131202、20131203不同批號(hào)的龍膽酊樣品和自制樣品中龍膽苦苷的含量分別為2.090、2.036、2.040、1.525、1.527、1.529、2.197 mg，平均含量為1.849 mg。

2.8樣品含量限度根據(jù)“2.7”項(xiàng)下7批樣品中龍膽苦苷的含量實(shí)測(cè)值，計(jì)算出7批樣品的龍膽苦苷含量平均值為1.849 mg，按其平均含量的80%為龍膽酊中龍膽苦苷含量測(cè)定的含量限度，確定含量限度為每1 mL龍膽酊中含龍膽以龍膽苦苷(C16H20O9)計(jì)不得低于1.48 mg。

3 結(jié)論與討論

3.1含量測(cè)定成分的選擇龍膽酊是龍膽經(jīng)加工制成的酊劑，所以龍膽為其主藥，《中國(guó)獸藥典》2015年版中龍膽及其制劑龍膽瀉肝散質(zhì)量控制的目標(biāo)成分均為龍膽苦苷，而龍膽苦苷也是龍膽的主要活性成分之一，因此龍膽酊中含量測(cè)定的成分選擇為龍膽苦苷。

3.2樣品前處理方法的選擇龍膽酊是龍膽最粗粉，用40%乙醇作溶劑，浸漬24 h后，按照滲漉法制得，因此樣品前處理方法相比提取龍膽原藥材要方便、簡(jiǎn)單，參考《中國(guó)獸藥典》2015年版二部龍膽瀉肝散含量測(cè)定項(xiàng)下前處理方法進(jìn)行樣品處理，結(jié)果表明該方法能夠較完全地提取出龍膽酊中的龍膽苦苷。

3.3色譜條件的優(yōu)化高效液相色譜法的流動(dòng)相常以水相和有機(jī)相混合使用，該研究在參考相關(guān)文獻(xiàn)和《中國(guó)獸藥典》2015年版二部中龍膽瀉肝散含量測(cè)定的基礎(chǔ)上，分別考察了甲醇-0.2%磷酸、乙腈-0.2%磷酸、甲醇-0.1%冰醋酸等不同流動(dòng)相下龍膽苦苷的分離情況，結(jié)果表明，甲醇-0.2%磷酸和乙腈-0.2%磷酸作為流動(dòng)相時(shí)分離效果好，無(wú)顯著差異，但是考慮到乙腈毒性大和使用成本高，故選擇甲醇-0.2%磷酸作為流動(dòng)相；通過(guò)改變甲醇和0.2%磷酸比例，確定最佳洗脫條件，即甲醇-0.2%磷酸溶液(20∶80，V/V)等度洗脫，該條件下色譜峰峰型好，保留時(shí)間穩(wěn)定，能消除雜質(zhì)峰的干擾，分離度達(dá)到要求。

采用高效液相色譜法測(cè)定龍膽酊中龍膽苦苷的含量，該方法簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好，為完善中藥龍膽酊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了方法和依據(jù)，可以彌補(bǔ)《中國(guó)獸藥典》2015年版二部中沒(méi)有收載龍膽酊主要活性成分龍膽苦苷的含量測(cè)定方法，含量限度為每1 mL龍膽酊中含龍膽以龍膽苦苷(C16H20O9)計(jì)不得少于1.48 mg。