花敬涵，楊靜文，胡雪芹，張洪斌

(合肥工業(yè)大學食品與生物工程學院，安徽合肥 230009)

環(huán)糊精(cyclodextrins，CDs)是含有親水外部和疏水中心腔的環(huán)狀低聚糖，由于它們具有能夠與許多難溶性親脂性分子形成水溶性包合物的獨特優(yōu)勢，故被廣泛應用于制藥、紡織、農(nóng)業(yè)、化妝品、化學和食品工業(yè)等領域[1-3]。CDs通常由淀粉或淀粉衍生物經(jīng)環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶(cyclodextrin glycosyltransferase，CGTase，EC 2.4.1.19)催化合成[4]。CGTase是α-淀粉酶家族的重要成員，是一種細胞胞外酶，可催化淀粉或多糖中α-1，4鍵裂解成CDs[5-6]。

CGTase的來源以細菌和古細菌居多，而真菌較少，這其中又以芽孢桿菌為主[3，7]。將CGTase基因在合適宿主中進行異源表達仍被認為是提高CGTase產(chǎn)量的有效方法，大約50%的商業(yè)化生產(chǎn)的CGTase是通過異源生產(chǎn)獲得的[7-10]。在眾多表達宿主中，大腸桿菌由于其低成本、易培養(yǎng)和高蛋白表達量，被認為是CGTase異源表達的最理想宿主[7，10]。VAN等[11]描述了環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶催化合成環(huán)糊精的具體機制。CGTase可以催化4種反應：環(huán)化、偶聯(lián)、歧化和水解[12]。其中，環(huán)化反應(淀粉中α-糖苷鍵斷裂，供體的一部分被分離出來作為受體環(huán)化產(chǎn)生CDs)是CGTase的特異性反應，產(chǎn)物多以 α-CD、β-CD、γ-CD這3種混合物的形式存在；偶聯(lián)反應(CDs的環(huán)狀結(jié)構(gòu)中α-糖苷鍵裂解，所得的寡糖轉(zhuǎn)移至受體底物形成糖基化產(chǎn)物)被認為是環(huán)化的逆反應；歧化反應(直鏈低聚糖的α-糖苷鍵斷裂，產(chǎn)生的葡萄糖或低聚糖作為糖基供體轉(zhuǎn)移到受體底物，生成聚合度不同的糖基化產(chǎn)物)和水解反應(水分子參與反應，催化底物分解成低聚糖)；環(huán)化、偶聯(lián)和歧化反應均具有轉(zhuǎn)糖基功能，其活性通常大于水解酶活[11，13-14]。

CGTase催化淀粉合成CDs，其產(chǎn)物主要是α-、β-和γ-CD的混合物(分別具有6、7和8個葡萄糖單元)，這給CDs的后續(xù)分離和純化帶來困難[3，7，15-16]。因此，提高催化產(chǎn)物的專一性對特定環(huán)糊精的實際生產(chǎn)具有重要意義，即產(chǎn)物特異性。近年來提高環(huán)糊精的產(chǎn)物特異性一直是研究熱點，主要流行的2種有效策略包括向反應混合物中添加有機溶劑和使用定點突變來改變CGTase的結(jié)構(gòu)[16-18]。盡管添加有機溶劑可以提高環(huán)糊精的特異性和總收率，但溶劑(例如甲苯或丙酮)的毒性和從最終產(chǎn)品中去除的成本限制了環(huán)糊精產(chǎn)品的大規(guī)模生產(chǎn)，特別是食品工業(yè)[18]。與添加有機溶劑作為復合劑相比，對CGTase進行分子改造的方法更環(huán)保且成本更低[16]。因此，理性改造CGTase以提高其產(chǎn)物特異性是必要的。

筆者對多種來源的CGTase基因進行序列比對，結(jié)果顯示不同組的CGTase的殘基31性質(zhì)各不相同(圖1)。而蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)來源的CGTase 中Ala47與環(huán)狀芽孢桿菌(B.circulans)Ala31具有高度相似性。對蠟狀芽孢桿菌來源的CGTase中Ala47進行了定點突變，并研究了47位氨基酸側(cè)鏈對其環(huán)糊精產(chǎn)物特異性的影響，探討此位點對CGTase產(chǎn)物特異性的影響，還分析了相關機制。

1 材料與方法

1.1菌種、材料與試劑將生物制藥與酶工程實驗室構(gòu)建保存的重組質(zhì)粒pBV220-cgt用作PCR反應的DNA模板，質(zhì)粒pET-22b(上海生工生物工程公司)作為基因表達載體。限制性核酸內(nèi)切酶(BamHI、SalI)、DNA聚合酶(FastPfu DNA Polymerase)、DNA連接酶(T4DNA Ligase)、Fast Mutagenesis System試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、用于表達的宿主菌E.coliBL21(DE3)和用于克隆的宿主菌E.coliDMT、E.coliDH5α均購自北京全式金公司。

α-CD、β-CD和γ-CD的標準樣品購自上海生工生物工程公司(中國上海)，引物合成和DNA測序由蘇州金唯智生物科技有限公司提供服務；其余試劑均為分析級。

1.2儀器與設備Life Eco PCR基因擴增儀購自杭州博日科技有限公司；Knauer高效液相色譜儀(包括示差檢測器及色譜工作站)購自德國諾爾公司；TSKgel Amide-80 5 μm 色譜柱(250 mm×4.6 mm)購于東曹(上海)生物科技有限公司。

1.3方法

1.3.1β-CGTase基因的克隆。使用重組質(zhì)粒pBV220-cgt作為模板，利用 Primer Premier軟件設計引物，通過PCR擴增蠟狀芽孢桿菌來源的β-CGTase的基因，其中設計的正向引物序列是5′-CGCGGATCCGATGATTACGCCAAGCTTTA-3′，反向引物序列是5′-ACGCGTCGACTTACCAATTTGATATGACC-3′，引物含有BamHI和SalI限制性位點(下劃線)。具體擴增條件如下：94 ℃預變性3 min；接著進行30個循環(huán)(94 ℃30 s，55 ℃1 min，72 ℃2 min)；最后72 ℃保溫10 min。

隨后用限制酶消化擴增的PCR片段，將PCR擴增產(chǎn)物與經(jīng)BamHI、SalI雙酶切的pET22b載體連接，得到重組質(zhì)粒pET22b-cgt，隨后通過熱激法將重組質(zhì)粒pET22b-cgt轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α。在經(jīng)過涂布氨芐西林的固體LB抗性篩選后，挑選陽性克隆進行DNA測序，測序正確的E.coliDH5α即含有pET22b-cgt的克隆菌。

1.3.2重組β-CGTase的表達和純化。從克隆菌中提取質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化到E.coliBL21(DE3)中，得含重組質(zhì)粒的表達菌。將表達菌的菌株接種到含氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基中(1%V/V接種量)，置于轉(zhuǎn)速250 r/min、37 ℃下過夜培養(yǎng)；次日吸取適量種子培養(yǎng)菌液轉(zhuǎn)接至新鮮LB培養(yǎng)基富集培養(yǎng)，在菌液濃度OD600達1.0時加入 IPTG并置于25 ℃下發(fā)酵誘導；在4 ℃、8 000 r/min下離心得到菌體沉淀，按照菌體干重加入對應量的甘氨酸-NaOH緩沖液(pH為8.5)；隨后振蕩、超聲破碎、離心，取上清液，即粗酶液。設計單因素試驗，分別研究培養(yǎng)溫度、菌濃(OD600)、IPTG劑量和誘導時間對β-CGTase表達量的影響。

通過硫酸銨沉淀和凝膠過濾技術對β-CGTase進行濃縮純化。具體操作：使用質(zhì)量分數(shù)為60%的硫酸銨對β-CGTase進行濃縮，緩慢且溫和地攪拌混合物以有效促進鹽析；待過夜鹽析后，在4 ℃、8 000 r/min離心20 min，將沉淀重懸于10 mL 0.05 mol/L甘氨酸-NaOH緩沖液(pH8.5)中；隨后使用Sephadex G-100色譜柱(2.0 cm×80 cm)純化β-CGTase，用甘氨酸-NaOH緩沖液(pH8.5)以20 mL/h的流速洗脫結(jié)合的β-CGTase。通過SDS-PAGE[19]測定β-CGTase的分子量。

1.3.3酶活力和蛋白含量的測定方法。酶活的測定采用碘值法[8]，具體方法為取10 μL適量稀釋的酶液，加入0.2 mol/L甘氨酸-NaOH緩沖液(pH 8.5)200 μL，加入200 μL質(zhì)量濃度為0.2%的可溶性淀粉，在40 ℃、pH為8.5的甘氨酸-NaOH體系中反應10 min后，加入0.5 mol/L的冰乙酸500 μL終止反應。通過加入3 mL質(zhì)量濃度為0.005%的碘液進行顯色，同時以不加酶液的等量蒸餾水作為對照，根據(jù)700 nm波長下的吸光度(OD700)確定酶活，一個酶活單位定義為使吸光度下降10%的酶量[20]。

以牛血清白蛋白作為標準蛋白繪制標準曲線，根據(jù)標準曲線測定蛋白含量，整個過程通過Bradford法完成[21-22]。

1.3.4酶學性質(zhì)研究。以下關于β-CGTase酶學性質(zhì)幾項指標的測定均采用碘值法，并將在溫度為55 ℃、pH為8.5下測定的酶活數(shù)值記為100%，以此計算相對酶活、剩余酶活。

1.3.4.1β-CGTase的最適溫度。將β-CGTase在40～100 ℃范圍內(nèi)不同溫度下孵育10 min后，測定各溫度下的剩余相對酶活，確定β-CGTase的最適溫度。

1.3.4.2β-CGTase的最適pH。在最適的pH條件下，酶的活性最高。分別用以下各緩沖液替換0.2 mol/L甘氨酸-NaOH緩沖液(pH 8.5)，采用碘值法測定酶活以確定β-CGTase的最適pH：0.1 mol/L檸檬酸鈉緩沖液(pH4.0～6.0)、0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.0～8.0)、0.2 mol/L甘氨酸-NaOH緩沖液(pH 9.0～11.0)。

1.3.4.3β-CGTase的溫度穩(wěn)定性。將0.01 mL酶與0.2 mL 0.2 mol/L甘氨酸-NaOH緩沖液(pH 8.5)在不同溫度(40～90 ℃)下孵育30 min后計算剩余酶活以測定β-CGTase的溫度穩(wěn)定性。

1.3.4.4β-CGTase的pH穩(wěn)定性。將0.01 mL純化的酶分別在以下緩沖液中孵育30 min后測定剩余酶活以判斷β-CGTase的pH穩(wěn)定性：0.1 mol/L檸檬酸鈉緩沖液(pH 4.0～6.0)、0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.0～8.0)、0.2 mol/L甘氨酸-NaOH緩沖液(pH 9.0～11.0)。

1.3.5酶法合成環(huán)糊精及HPLC檢測。將可溶性淀粉溶于甘氨酸-NaOH緩沖液(pH 8.5)中，并在不斷攪拌下煮沸至淀粉糊化，制備0.3 mol/L糊化淀粉。待糊化淀粉溶液冷卻至室溫，按照800 U/g淀粉的加酶量加入酶液。反應液經(jīng)煮沸、離心及過濾后，通過HPLC檢測并結(jié)合內(nèi)標法計算可知CDs的生成量。

高效液相色譜(HPLC)檢測條件：液相檢測器為示差檢測器，流動相為65%乙腈/35%水，流速為1.0 mL/min，色譜柱為X-Amide色譜柱，柱溫為25 ℃。

1.3.6突變菌株的構(gòu)建。以重組表達質(zhì)粒pET22b-cgt為模板，引入各突變酶的設計引物(表1)，分別將47位的丙氨酸突變?yōu)榻z氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、精氨酸，得到單突變體A47S、A47M、A47Y、A47R。各突變體的PCR反應程序均為94 ℃預變性3 min；接著進行30個循環(huán)(94 ℃10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃4 min)；最后72 ℃保溫10 min。各突變體的PCR反應體系(50 μL)均為質(zhì)粒pET22b-cgt1 μL，正向引物(10 μmol/L)1 μL，反向引物(10 μmol/L)1 μL，2×TransStart FastPfu PCR Supermix 25 μL，ddH2O 22 μL。

表1 突變酶的引物設計

PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗證其大小無誤后，向PCR產(chǎn)物中加1 μL DMT酶，混勻，37 ℃孵育1 h，去除甲基化模板。然后將得到的酶切產(chǎn)物純化，轉(zhuǎn)化到E.coliDMT感受態(tài)細胞內(nèi)，經(jīng)過含氨芐青霉素的LB平板篩選，挑選陽性克隆并提取質(zhì)粒進行測序。將測序結(jié)果正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coliBL21(DE3)中，即得突變菌株的表達菌。

2 結(jié)果與分析

2.1蠟狀芽孢桿菌β-CGTase的克隆與序列分析來源于蠟狀芽孢桿菌的β-CGTase(GenBank：KF269705.1)的基因(2 085 bp)被克隆并在大腸桿菌BL21(DE3)中表達。限制性分析表明大約2 100 bp的PCR片段(圖1)被插入到pET22b載體中，得到重組質(zhì)粒pET22b-cgt，其結(jié)構(gòu)見圖2。核苷酸序列測序結(jié)果表明，β-CGTase基因為2 085 bp，編碼694個氨基酸殘基，其核苷酸序列以登錄號KF269705保存在GenBank數(shù)據(jù)庫中。

注：1.經(jīng)BamHI和SalI酶切得到的片段；M.DL8000 DNA MarkerNote：1.The fragment obtained by BamHI and SalI enzyme digestion；M.DL8000 DNA Marker圖1 重組質(zhì)粒電泳結(jié)果Fig.1 Electrophoresis results of recombinant plasmid

圖2 重組質(zhì)粒pET22b-cgtFig.2 pET22b-cgt recombinant plasmid

2.2重組β-CGTase的表達圖3A表明重組β-CGTase的最佳表達溫度為25 ℃，培養(yǎng)溫度對重組β-CGTase工程菌的表達有明顯影響，這是因為在高溫下，酶的表達速率太快而不能被正確折疊，因此形成了無活性的包涵體；而較低的培養(yǎng)溫度可以減少包涵體的產(chǎn)生以產(chǎn)生更高的活性。由圖3B可知，誘導的最佳菌體濃度是OD600為1.8對應的菌濃。當IPTG濃度為0.2 mmol/L時，誘導時間為16 h，CGTase顯示出高酶活，因為高濃度的IPTG可以抑制細菌的生長(圖3C、3D)。

2.3β-CGTase的純化及酶學性質(zhì)通過硫酸銨沉淀成功純化β-CGTase，然后進行Sephadex G-100柱層析。純化的β-CGTase在SDS-PAGE上顯示出分子量為68 kD的單個條帶(圖4)，說明該酶在大腸桿菌中成功獲得表達。在最佳發(fā)酵條件下，粗酶的比酶活可達5 239 U/mL。而經(jīng)過Sephadex G-100柱洗脫可得到純化酶，其比酶活是粗酶的10.68倍，純化產(chǎn)率為30.91%(表2)。

由圖5A、5B可知，該酶的最適溫度為55 ℃、最佳pH為8.5。其酶活在pH為7.0～9.0時相對穩(wěn)定(圖5B、5D)，表明蠟狀芽孢桿菌來源β-CGTase的催化條件適宜弱堿性，與文獻報道CGTase的最適pH(5.0～8.0)結(jié)果一致[23]。圖5C表明，當溫度升至70 ℃時，酶仍表現(xiàn)出較高的活性，這有利于其催化淀粉合成CDs。因為淀粉結(jié)構(gòu)中包含無定形區(qū)和結(jié)晶區(qū)，前者通常以松散結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)，容易被外界因素影響；后者大多由雙螺旋結(jié)構(gòu)形成，相對致密，不易被破壞，同時也難以被β-CGTase作用[24]。而隨著溫度的升高，淀粉的溶解度顯著增加并且其晶體結(jié)構(gòu)被破壞，這有利于提高β-CGTase的催化效率從而改善環(huán)糊精的產(chǎn)率[24-25]。

2.4影響環(huán)糊精生成的因素

2.4.1溫度對β-CD產(chǎn)率的影響。在酶的催化反應中，溫度對產(chǎn)物生成起重要作用。在pH 8.5和不同溫度(40～70 ℃)下，向0.3 mol/L糊化淀粉溶液中加入800 U/g淀粉的β-CGTase進行反應。由圖6可知，溫度以2種方式影響β-CGTase酶促反應的速率。首先，升高溫度(40～55 ℃)會增加底物分子的熱能并提高反應速率，從而提高β-CD的產(chǎn)率(16.43%→28.49%)。然而，較高的溫度(>55 ℃)會產(chǎn)生第2種效應，即增加β-CGTase蛋白結(jié)構(gòu)的分子熱能，這會使非共價鍵(例如氫鍵和范德華力)被削弱，而這些作用力維持β-CGTase的三維結(jié)構(gòu)，這樣就導致β-CGTase蛋白結(jié)構(gòu)的解折疊，從而使β-CD產(chǎn)率降低(28.49%→13.23%)。由圖6可知，最適合β-CD生產(chǎn)的溫度為55 ℃，此時β-CD產(chǎn)率最高，這也與相似來源CGTase的最佳催化溫度接近，即環(huán)狀芽孢桿菌 E192來源的β-CGTase最佳溫度為60 ℃[26]；Qiu等[27]使用來自地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)的CGTase，在55 ℃時γ-CD的最大產(chǎn)率為32.9%；來自克拉氏芽孢桿菌(B.clarkii)7364的CGTase在55 ℃時其CD產(chǎn)率達到最大值45.3%[28]。

注：A.培養(yǎng)溫度對β-CGTase酶活力的影響；B.OD600對β-CGTase酶活力的影響；C.IPTG濃度對β-CGTase酶活力的影響；D.誘導時間對β-CGTase酶活力的影響Note：A.effect of culture temperature on activity of β-CGTase；B.effect of OD600 on activity of β-CGTase；C.effect of IPTG concentration on activity of β-CGTase；D.effect of induction time on activity of β-CGTase圖3 β-CGTase表達及發(fā)酵條件的優(yōu)化Fig.3 Fermentation optimization research on expression of recombinant β-CGTase

注：M.蛋白質(zhì)Marker；1.粗酶β-CGTase；2.硫酸銨沉淀后的酶β-CGTase；3.純化后的β-CGTaseNote：M.Protein Marker；1.crude enzyme β-CGTase；2.enzyme after ammonium sulfate precipitation；3.purified CGTase圖4 大腸桿菌BL21(DE3)β-CGTase的SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of the recombinant β-CGTase from the E.coli BL21(DE3)

種類Type總酶活Total enzyme activityU總蛋白量Total protein contentmg比酶活Specific enzyme activityU/mg純化倍數(shù)Purificationfold剩余酶活Residual enzyme activity∥%粗酶Crude enzyme60 33011.405 292.1 — —60%(NH4)2SO441 132 4.808 569.21.6268.18SephadexG-10018 6480.3356 509.110.6830.91

2.4.2pH對β-CD產(chǎn)率的影響。在不同pH(6.0～10.0)和溫度55 ℃下，將800 U/g酶粗溶液與0.3 mol/L可溶性淀粉一起反應。由圖7可知，當pH為8.5時，β-CD的產(chǎn)率最高。最佳pH(8.0-9.0)的輕微偏差導致β-CGTase活性位點的電離發(fā)生變化，β-CD的產(chǎn)率略有下降(28.27%→25.94%和28.27%→26.47%)；當pH變化很大(> pH 10.0和

注：A.溫度對β-CGTase酶活力的影響；B.pH對β-CGTase酶活力的影響；C.溫度對β-CGTase酶穩(wěn)定性的影響；D.pH對β-CGTase酶穩(wěn)定性的影響Note：A.effect of temperature on activity of β-CGTase；B.effect of pH on activity of β-CGTase；C.effect of temperature on stability of β-CGTase；D.effect of pH on stability of β-CGTase圖5 重組β-CGTase的酶學性質(zhì)Fig.5 Properties of recombinant β-CGTase

圖6 溫度對β-CD產(chǎn)率的影響 Fig.6 Effect of temperature on yield of β-CGTase

圖7 pH對β-CD產(chǎn)率的影響 Fig.7 Effect of pH on yield of β-CD

2.5突變酶的構(gòu)建由圖8可知，各組在8 000 bp左右處有條帶產(chǎn)生，大小與目的條帶基本吻合。

注：1.Wild；2.A47M；4.A47S；5.A47Y；6.A47R；3.DL8000 DNA Marker圖8 各突變酶的PCR擴增條帶Fig.8 PCR amplification band of each mutant enzyme

突變酶陽性克隆的測序結(jié)果見圖9。由圖9多重序列比對可知，各突變酶第47位氨基酸位點對應的堿基序列由GCG(丙氨酸的密碼子)突變?yōu)镃GT(精氨酸的密碼子)、ATG(蛋氨酸的密碼子)、AGC(絲氨酸的密碼子)、TAT(酪氨酸的密碼子)，表明突變酶A47R 、A47M、A47S、A47Y構(gòu)建成功。

2.6定點突變對β-CGTase酶活力的影響采用碘值法測定各種酶的酶活，與原始酶相比，突變酶A47M、A47S的酶活有了不同程度的降低，而A47Y和A47R的酶活變化較小(表3)。幾種突變酶的酶活數(shù)值比較可觀，可用于環(huán)糊精的制備反應。

圖9 β-CGTase在47位氨基酸位點突變的序列比對Fig.9 Multiple sequence alignment of the region around the residue 47 in β-CGTase

2.7定點突變對CDs產(chǎn)量的影響用原始酶Wild和突變酶A47S、A47M、A47Y、A47R按照“1.3.6”所述方法制備及檢測反應液，β-CD、γ-CD的生成量及產(chǎn)物特異性(β-CD/γ-CD)變化不一(表4)。而突變后的氨基酸變?yōu)橛H水性氨基酸(Ser、Arg)時，β-CD、γ-CD產(chǎn)量都明顯增加，而且β-CD/γ-CD比值增大，表示親水性氨基酸更利于CDs合成，其中對β-CD的影響更明顯。而突變后的氨基酸變?yōu)槭杷园被?Tyr、Met)時，A47M催化合成的CDs生成量減少，且β-CD/γ-CD比值也下降，說明疏水性氨基酸對β-CD產(chǎn)量的影響更大；而A47Y由于突變后氨基酸(Tyr)的疏水性低于Ala的疏水性，故β-CD、γ-CD合成量均比原始酶的多，這也與文獻得到的結(jié)論相似[16]。

表3原始酶和突變酶的酶活比較

Table3Comparisonofenzymeactivityofwild-typeandmutantβ-CGTase

酶種類Types of enzyme比酶活Specific enzyme activity∥U/mLOD700Wild 5 2390.018A47M4 7680.020A47S4 6210.023A47Y5 3210.016A47R5 5480.013

表4原始酶和突變酶作用于淀粉的CDs產(chǎn)量比較

Table4ComparisonoftheyieldofCDswithwild-typeandmutantβ-CGTase

酶種類Types of enzymeβ-CDmg/mLγ-CDmg/mLβ-CD/γ-CDWild 14.124.732.99A47Y15.406.282.45A47M13.424.662.88A47S16.364.173.92A47R17.665.153.43

3 結(jié)論

來自蠟狀芽孢桿菌的β-CGTase被克隆并在大腸桿菌中異源表達。在最佳誘導條件下，β-CGTase的比活力達5 292 U/mL。β-CGTase的分子量約為68 kD，最適溫度和pH分別為55 ℃和8.5。通過控制pH、反應溫度、反應時間，β-CD產(chǎn)量可達14.12 mg/mL且高特異性(產(chǎn)物中β∶γ=74.75%∶25.04%)。通過序列對比選取了第47位氨基酸(Ala)進行定點突變，構(gòu)建了A47R、A47M、A47S、A47Y，發(fā)現(xiàn)活性區(qū)域中第47位氨基酸對產(chǎn)物特異性具有一定的影響，其中親水性氨基酸更利于CDs(尤其β-CD)的合成，這為酶法合成β-CD的工業(yè)應用提供了方法。