李卓昱，鮑玉杰，尚玉曼，袁增智，2*

(1.天津師范大學生命科學學院，天津 300387；2.天津市動植物抗性重點實驗室，天津 300387)

半滑舌鰨是我國北方重要的海水養(yǎng)殖魚類，隸屬鰈形目(Pleuronectiformes)舌鰨科(Cnoglossidae)舌鰨屬(Cynoglossus)，作為一種深受廣大消費者歡迎的魚種，具有較高的經(jīng)濟食用價值[1]。近年來，各類疾病的出現(xiàn)使半滑舌鰨的健康狀況和養(yǎng)殖事業(yè)受到極大威脅，其中以細菌性疾病居多。例如，天津地區(qū)海水養(yǎng)殖場中的半滑舌鰨發(fā)生了以魚鰭基部出血、體表潰爛、拒食并最終死亡等癥狀為特征的體表潰瘍病，嚴重影響了養(yǎng)殖半滑舌鰨的產(chǎn)量。徐曉麗等[2]已從患病的半滑舌鰨體表病灶分離到哈維氏弧菌(Vibrioharveyi)和魚腸道弧菌(Vibrioichthyoenteri)，經(jīng)回感試驗證實這2株菌可使半滑舌鰨患病死亡，確定其為半滑舌鰨體表潰瘍病的致病菌。高桂生等[3]從自然發(fā)病的半滑舌鰨肝臟和腎臟處分離到一株熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)，人工感染試驗發(fā)現(xiàn)該菌可以引起半滑舌鰨全身性細菌敗血癥。王燕[4]認為美人魚發(fā)光桿菌殺魚亞種為患病舌鰨的病原菌。為進一步闡明養(yǎng)殖半滑舌鰨體表潰瘍病病原及發(fā)病機制，筆者開展了相關(guān)病原菌的篩選工作，并從患潰瘍病的半滑舌鰨體表篩選出一株溶藻弧菌，編號為H1B6，從形態(tài)觀察、生理生化鑒定、Biolog微生物鑒定、16S rDNA序列分析方面對分離菌株進行了鑒定，旨在探究其致病性，為今后半滑舌鰨潰瘍病的防控與治療提供一定的科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1培養(yǎng)基。TCBS：稱取該成品30.0 g溶于1 L蒸餾水中，攪拌使其溶解，將pH調(diào)至(7.3±0.2)，并使用高壓滅菌鍋121 ℃下高壓滅菌15 min，鋪平板備用。2216E瓊脂：稱取該成品52.3 g溶于1 L蒸餾水中，攪拌使其溶解，將pH調(diào)至(7.3±0.2)，并使用高壓滅菌鍋121 ℃高壓滅菌15 min，鋪平板備用。TCBS和2216E瓊脂購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

1.1.2試劑與儀器。

1.1.2.1試劑。2×TaqPCR Master Mix購自博邁德生物有限公司；生化鑒定管購自杭州微生物試劑有限公司；Biolog GEN Ⅲ 鑒定板購自基因有限公司。

1.1.2.2儀器。超凈工作臺(SW-CJ-1FD，江蘇通凈)、高壓滅菌鍋(SX-500，江陰濱江醫(yī)療有限公司)、pH計(METTER TOLEDO，北京六一儀器廠)、離心機(Centrifuge5415R Eppendorf)、PCR儀(BIO-RAD)、恒溫培養(yǎng)箱(SPX-150B-D，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)、數(shù)顯恒溫水浴鍋(HH-3A型，金壇市金南儀器制造有限公司)、電泳儀(DYY-6C型，北京六一儀器廠)、全自動微生物鑒定系統(tǒng)(MicroStation Biolog)。

1.1.3試驗動物。患病的半滑舌鰨取自天津市海發(fā)珍品實業(yè)發(fā)展有限公司，體長約20 cm，攻毒用斑馬魚購自天津市中環(huán)花鳥魚蟲市場，體長4～6 cm。

1.2方法

1.2.1病原菌的分離。取患潰瘍病的半滑舌鰨，病魚表現(xiàn)為體表潰爛、腹部腫脹、活力減弱。在超凈工作臺中用無菌棉球擦拭病魚體表潰爛處，取接種環(huán)輕輕蘸拭潰爛處，接種于TCBS及2216E固體培養(yǎng)基上。28 ℃下恒溫培養(yǎng)24 h，選取優(yōu)勢菌種進行分離與純化，將連續(xù)分離、純化3次得到的菌株置于甘油中保種，-80 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.216S rDNA檢測。

1.2.2.116S rDNA的PCR擴增。該試驗從患病的半滑舌鰨體表潰爛處分離到一株優(yōu)勢菌株，命名為H1B6，將純化得到的H1B6菌株在TSB液體培養(yǎng)基中37 ℃，220 r/min過夜培養(yǎng)16 h，分別取200 μL菌液100 ℃沸水煮10 min，12 000 r/min離心10 min，取上清即DNA作為PCR模板。PCR反應(yīng)體系如下：模板1 μL、混合引物1 μL、2×TaqPCR MasterMix 12.5 μL、無菌水10.5 μL。PCR反應(yīng)條件如下：預變性94 ℃，2 min；變性94 ℃30 s、退火58 ℃30 s、延伸72 ℃，30 s；終延伸72 ℃2 min。PCR引物為細菌16S rDNA的通用引物，正向引物27F為AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，反向引物1492R為GGTTACCTTGTTACGACTT，由華大基因合成。

1.2.2.2PCR產(chǎn)物的檢測及序列分析。取2 μL PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。上述PCR產(chǎn)物由上海生工生物工程有限公司測序，測序結(jié)果通過NCBI網(wǎng)站的BLAST檢索系統(tǒng)進行同源序列比對分析，從中選取高度相似序列，使用MEGA6(Molecular evolutionary genetics analysis，MEGA)軟件構(gòu)建16S rDNA的系統(tǒng)進化樹。

1.2.3生理生化鑒定。將純化得到的H1B6菌株劃線于TSB培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)24 h后，使用無菌牙簽挑取單菌落接種于生化鑒定管中，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察其顏色變化。參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》[5]，確定其生理生化特性。

1.2.4Biolog微生物鑒定。將H1B6菌株置于TSB平板上活化2次，次日使用無菌棉簽挑取單菌落接種于B接種液中，充分混合均勻后將其濁度調(diào)至(95±1)%，每孔100 μL加至GEN Ⅲ鑒定板上，33 ℃下培養(yǎng)16～24 h。在鑒定操作軟件中設(shè)置相應(yīng)參數(shù)選項(鑒定板號碼、鑒定板類型、參照規(guī)程和培養(yǎng)時間)后將鑒定板放入OmniLog讀數(shù)儀，經(jīng)與數(shù)據(jù)庫比對后進行結(jié)果分析，并將所得數(shù)據(jù)進行保存。

1.2.5斑馬魚攻毒試驗。將斑馬魚實驗室飼養(yǎng)水溫控制在(28±1)℃，觀察7 d確認健康狀態(tài)良好后進行細菌攻毒試驗。將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的H1B6菌株濃度分別調(diào)至108、107、106、105CFU/mL，并使用微量注射器通過腹腔對成年斑馬魚進行注射刺激，對照組注射等量的生理鹽水，每組5只，24 h內(nèi)統(tǒng)計其死亡率并觀察魚體是否出現(xiàn)異?，F(xiàn)象。試驗結(jié)果參考李翠萍等[6]的計算方法建立線性回歸方程，計算LD50。

2 結(jié)果與分析

2.1病魚臨床癥狀患體表潰瘍病的半滑舌鰨發(fā)病前期體表出現(xiàn)大量白色潰瘍點，活力減弱，攝食減少。隨著病情的加重，潰瘍面積逐漸逐漸增大，可引發(fā)大面積潰爛現(xiàn)象，甚至斷尾，腸道腫大、鼓出，幾乎脫出肛外(圖1)，嚴重時可致死。

2.2病原菌分離結(jié)果及形態(tài)特征該試驗篩選到一株優(yōu)勢菌株，編號H1B6，革蘭氏染色結(jié)果呈陰性，呈短桿狀(圖2)。該菌株在2216E培養(yǎng)基上呈1～2 mm圓形狀，無色透明，有擴散趨勢，有黏性，不易挑起。該菌株在綠色TCBS培養(yǎng)基上為黃色圓形菌落，表面光滑，富有黏性，見圖3。

圖1 患潰瘍病的半滑舌鰨 Fig.1 Cynoglossus semilaevis Günther diseased with canker

圖2 H1B6菌株的革蘭氏染色結(jié)果Fig.2 Gram staining result of H1B6 strain

圖3 TCBS培養(yǎng)基上H1B6菌株的菌落特征Fig.3 Colony features of H1B6 strain on TCBS plate

2.316SrDNA序列分析及進化樹分析以細菌DNA為模板，對其進行16S rDNA基因的PCR擴增，發(fā)現(xiàn)條帶單一，有一條1 500 bp左右大小與預期相符的單一條帶(圖4)。將序列拼接片段在NCBI網(wǎng)站上進行BLAST比對，發(fā)現(xiàn)菌株16S rDNA基因為弧菌屬，其中與副溶血性弧菌(序列號為KX860115.1)同源性高達100%，與溶藻弧菌(序列號為KT986175.1)同源性也高達100%，由此可初步判定H1B6致病菌為弧菌屬。與找到的與其同源性較高的序列進行系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析(圖5)，圖5顯示H1B6菌株與溶藻弧菌聚為一支。

注：M.DNA marker；1.16S rDNA圖4 H1B6菌株16S rDNA序列的PCR擴增結(jié)果Fig.4 PCR amplification results of 16S rDNA sequence of H1B6 strain

2.4生理生化鑒定生化鑒定結(jié)果(表1)表明，該菌株在

3%NaCl中可正常生長，可將葡萄糖分解為丙酮酸，丙酮酸繼續(xù)分解，產(chǎn)生甲酸、乳酸等，在M-R反應(yīng)中呈陽性。對蔗糖、甘露醇、賴氨酸、鳥氨酸的利用呈陽性，不可利用乳糖、精氨酸和硫化氫，V-P反應(yīng)呈陰性。將鑒定結(jié)果與《伯杰氏細菌鑒定手冊》中弧菌屬性狀進行比較[7-8]，可確定H1B6菌株與溶藻弧菌最為相似。

2.5Biolog微生物鑒定結(jié)果利用GENⅢ鑒定板對菌株H1B6的碳源利用及化學敏感性進行檢測，鑒定結(jié)果如圖6所示。菌株H1B3呈陽性反應(yīng)的有24個，呈陰性反應(yīng)的有42個，呈邊界值的反應(yīng)的有30個。碳源利用檢測呈陽性反應(yīng)的有11個，呈陰性反應(yīng)的有36個。化學敏感性檢測呈陽性反應(yīng)的有13個，呈陰性反應(yīng)的有6個。根據(jù)2個重要的鑒定參數(shù)SIM(相似性)及DIST(距離)可知，當SIM越接近于1，則相似性越高；若DIST小于5，即可確定其菌株分類。Biolog鑒定結(jié)果如表2所示，H1B6菌株為溶藻弧菌的PROB(可能性值)為0.986，SIM和DIST值均在可接受范圍內(nèi)，因此確定H1B6菌株為溶藻弧菌。

圖5 H1B6菌株16S rDNA序列系統(tǒng)進化樹分析Fig.5 The phylogenetic tree analysis of 16S rDNA sequence of H1B6 strain

鑒定項目 Identification item檢測結(jié)果Detection results 陽性對照Positive control鑒定項目Identification item檢測結(jié)果 Detection results 陽性對照Positive control葡萄糖Glucose(3%NaCl)++M-R++蔗糖Sucrose(3%NaCl)++V-P--乳糖Lactose(3%NaCl)--蛋白胨水Peptone water(3%NaCl)++甘露醇Mannitol(3%NaCl)++賴氨酸Lysine(3%NaCl)+V硫化氫Hydrogen sulfide(3%NaCl)--鳥氨酸Ornithine(3%NaCl)++精氨酸Arginine(3%NaCl)--

注：+為陽性，-為陰性，V為可變

Note：+，- and V stand for positive，negative and variable results，respectively

2.6斑馬魚毒力試驗結(jié)果毒力試驗結(jié)果如表3所示，腹腔注射6 h開始，Ⅲ、Ⅳ組斑馬魚表現(xiàn)出明顯的食欲不振、活力下降、失去方向感，并開始死亡。觀察死魚發(fā)現(xiàn)其體表充血，魚體泛白，黏液增多，腹部腫脹，尾部呈上翹狀，具有典型的急性細菌侵染敗血癥病理變化特征，如圖7所示。Ⅳ組12 h死亡率達100%，Ⅲ組24 h內(nèi)全部死亡，Ⅱ組累計死亡率僅為20%，此后再無死亡現(xiàn)象，Ⅰ 組和空白對照(CK)組無死亡現(xiàn)象。使用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件建立線性回歸方程y=107x-414 286(R2=0.988 4)，由該公式計算出H1B6菌株的24 h LD50值為4.58×106CFU/mL。

3 討論

該研究從患病的半滑舌鰨體表潰爛處分離得到一株菌株H1B6，根據(jù)16S rDNA序列測定和生理生化鑒定結(jié)果判定該菌株為溶藻弧菌。 16S rDNA被稱為“細菌化石”，是細菌系統(tǒng)分類研究中最常用的分子標尺[9]。16S rDNA序列測序結(jié)果顯示，H1B6菌株與溶藻弧菌、副溶血弧菌都具有高達100%的同源性，但由于缺少生理生化水平的證據(jù)，因此將其確定到種還缺乏強有力證據(jù)。由于不同細菌的代謝酶系統(tǒng)差異，對糖類、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等的利用也不同[10]，利用此特征，使用生化鑒定管建立生化反應(yīng)，結(jié)果參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》和已有研究中的溶藻弧菌特性[8，10-11]比較，確定H1B6菌株與溶藻弧菌最為相似。使用Biolog鑒定法，利用細菌對不同碳源代謝率差異，進一步確定了H1B6菌株為溶藻弧菌。

圖6 菌株H1B6在 GEN Ⅲ鑒定板上的鑒定結(jié)果Fig.6 Reactions of strain H1B6 on GEN Ⅲ identification plate

編號No.PROBSIMDIST物種Species10.9860.7762.964Vibrio alginolyticus20.0060.0046.204Vibrio harveyi30.0060.0036.255Vibrio aestuarianus40.0020.0016.970Vibrio splendidus

表3 斑馬魚人工感染試驗結(jié)果

注：A.感染斑馬魚；B.健康的斑馬魚Note：A.Infected zebrafish；B.Healthy zebrafish 圖7 感染溶藻弧菌斑馬魚的臨床癥狀 Fig.7 Clinical symptoms of zebrafish infected with V.alginolyticus

溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)是一種普遍存在于海水及淡水中的條件性致病菌，可感染水環(huán)境中的各類宿主[12]。目前已從凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)[11]、法老烏賊(Sepiapharaonis)[13]、大黃魚(Larimichthyscrocea)[14]、大菱鲆(Scophthalmusmaximus)[15]等生物體內(nèi)分離出該菌，并發(fā)現(xiàn)其可引發(fā)病害。Lv等[13]從患病的法老烏賊(Sepiapharaonis)體內(nèi)分離得到溶藻弧菌Wz11菌株，并證實該菌株在皮膚粘液以及組織液中有較高存活力，是法老烏賊的潛在致病菌。Xie等[16]通過對引起中國南海西沙群島的珊瑚感染珊瑚病PAWS的成因分析，篩選到2株優(yōu)勢菌種(XSBZ03和XSBZ14)，經(jīng)過Biolog鑒定、16S rRNA序列分析、生化反應(yīng)，均證實這2株菌為溶藻弧菌。因此，筆者認為其是PAWS病的致病因子，并隨水的轉(zhuǎn)移導致長期感染。

斑馬魚作為模式生物，具有遺傳背景清楚、易于獲得、飼養(yǎng)及操作簡便等優(yōu)點，因此被越來越多地運用于病原毒力分析研究中。李亞軍等[17]分析了裂腹魚源無乳鏈球菌血清型Ia(S07)和Ⅲ型(S03)毒力的差異性，分別腹腔接種不同濃度的S07和S03菌株于斑馬魚體內(nèi)，結(jié)果顯示S07株對斑馬魚的LD50值為1.88×103CFU/mL，S03株對斑馬魚的LD50值為7.09×107CFU/mL，表明Ia毒力顯著高于Ⅲ型。高艷俠等[18]從健康的尼羅羅非魚體內(nèi)篩選出一株益生菌LF01，并對其進行了生物安全性檢測，表明LF01株對羅非魚、斑馬魚、烏鱧3種魚均具有良好的安全性，即使在高濃度制劑感染下也無任何臨床癥狀。該研究中也將斑馬魚作為檢驗分離菌株毒力的模型。通過人工感染試驗發(fā)現(xiàn)，H1B6菌株對斑馬魚具有急性感染能力，毒力較強，提示該菌可能是導致半滑舌鰨體表潰瘍病的病因之一。在此基礎(chǔ)上，今后還需要開展進一步的研究工作，以探索該菌株的致病機制以及對半滑舌鰨的致病力，為半滑舌鰨體表潰瘍病的防治提供理論基礎(chǔ)。