董錫文，朱德旋，杜春梅*，姜忠元，韓 笑，張 宇

(1.佳木斯大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江佳木斯 154007；2.佳木斯大學(xué)應(yīng)用微生物研究所，黑龍江佳木斯 154007；3.佳木斯大學(xué)教育科學(xué)學(xué)院，黑龍江佳木斯 154007)

黑木耳[Aurieuzariaauricular(L.ex Hook.)Uzderw.]是世界上最早實現(xiàn)人工栽培的食用菌，其食用和藥用價值極高，深受消費者的普遍歡迎[1]。關(guān)于黑木耳生長研究已有很多[2-6]。有關(guān)黑木耳鎖狀聯(lián)合形成的研究也逐漸受到重視[7-8]，形成鎖狀聯(lián)合的菌絲再形成耳基的比例為100%，而不形成鎖狀聯(lián)合的菌絲形成耳基的比例僅為20%左右，且形成鎖狀聯(lián)合的菌絲形成耳基的時間比不形成鎖狀聯(lián)合的菌絲形成耳基的時間提前30 d左右。這說明形成鎖狀聯(lián)合的菌絲在形成黑木耳產(chǎn)量和降低生產(chǎn)成本方面具有重要影響，研究維生素對黑木耳鎖狀聯(lián)合菌絲形成的影響將會對實際生產(chǎn)，尤其是生產(chǎn)效益具有重要意義。

1 材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1菌株。黑木耳黑29購于黑龍江省微生物研究所。

1.1.2試劑。維生素B1片(山東仁和堂藥業(yè)有限公司)；維生素B2片(東北制藥集團沈陽第一制藥有限公司)；維生素B12片(上海信誼九福藥業(yè)有限公司)；維生素C片(山西國潤制藥有限公司)；葡萄糖(分析純，天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠)；瓊脂粉(生物試劑，北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司)。

1.1.3培養(yǎng)基?；A(chǔ)培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基)：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂18 g，水1 000 mL，pH 6.0。維生素培養(yǎng)基：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入不同濃度維生素，包括VB1培養(yǎng)基、VB2培養(yǎng)基、VB12培養(yǎng)基和VC培養(yǎng)基，pH 6.0。

1.1.4主要儀器與設(shè)備。MP1002電子天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)；恒溫培養(yǎng)箱(上海福瑪實驗設(shè)備有限公司)；光學(xué)顯微鏡(北京泰克儀器有限公司)；LDZX-75KBS立式壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠)；移液槍(Thermo Scientific公司)。

1.2試驗方法

1.2.1維生素母液的配制。將4種維生素制備成適當濃度的母液，用45 μm細菌濾膜進行過濾除菌，4 ℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2培養(yǎng)基的制備?；A(chǔ)培養(yǎng)基按照常規(guī)方法進行。維生素培養(yǎng)基采用基本培養(yǎng)基加維生素法，用移液槍吸取不同體積的4種維生素母液加入到基本培養(yǎng)基中，混勻倒平板，每種維生素終濃度分別為0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25和0.30 μg/mL。

1.2.3菌種活化與擴大培養(yǎng)。在25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中對黑29進行活化培養(yǎng)4 h后，在無菌條件下用接種鏟將斜面菌種轉(zhuǎn)接至基礎(chǔ)培養(yǎng)基上進行擴大培養(yǎng)，待長勢良好后進行后續(xù)試驗。

1.2.4單因素試驗。在擴大培養(yǎng)的黑29菌落周邊選取直徑0.86 cm健壯菌絲塊，接種至維生素培養(yǎng)基平板中央，在距接種塊2 cm處以45°角進行插片處理，每個平板插3個蓋玻片。每個變量設(shè)3個重復(fù)，以無維生素的基本培養(yǎng)基為空白對照。

1.2.5正交試驗。根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取最佳的3個維生素濃度，采用L9(34)正交試驗因素水平表對黑29鎖狀聯(lián)合菌絲形成所需維生素含量進行優(yōu)化試驗，每個組合設(shè)3個平行。

1.3測定項目與方法待黑29菌絲長滿蓋玻片，置于10×40倍顯微鏡下觀察記錄菌絲數(shù)、鎖狀聯(lián)合菌絲數(shù)并計算鎖狀聯(lián)合菌絲比率。鎖狀聯(lián)合菌絲比率=鎖狀聯(lián)合菌絲數(shù)/菌絲數(shù)×100%。

1.4數(shù)據(jù)分析試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0和Excel進行統(tǒng)計分析與做圖。

2 結(jié)果與分析

2.1單因素試驗結(jié)果從圖1可以看出，在試驗濃度范圍內(nèi)，隨著4種維生素濃度的升高，黑29鎖狀聯(lián)合菌絲平均比率先升高后降低。當VB1和VB12濃度分別為0.25和0.15 μg/mL時，鎖狀聯(lián)合菌絲平均比率最高分別為76.33%和80.97%，比對照菌株分別提高了37.04%和45.37%。VC培養(yǎng)基對鎖狀聯(lián)合菌絲平均比率影響最大，當VC濃度為0.15 μg/mL時，該比率高達90.60%，比對照菌株提高了62.66%；VB2培養(yǎng)基對該比率影響最小，當VB2濃度為0.20 μg/mL時，該比率為67.83%，比對照菌株提高了近21.78%。因此，單因素試驗中可以確定不同維生素的最佳濃度。即VB1濃度為0.25 μg/mL、VB2濃度為0.20 μg/mL、VB12和VC濃度為0.15 μg/mL。

圖1 不同種類濃度維生素對黑29鎖狀聯(lián)合菌絲比率的影響Fig.1 The effect of different kinds and concentrations vitamin on ratios of hyphal clamp connection in H29

2.2正交試驗結(jié)果將單因素試驗最佳結(jié)果應(yīng)用于正交試驗，維生素濃度正交試驗因素水平見表1，正交試驗結(jié)果見表2。從表2可以看出，影響黑29鎖狀聯(lián)合菌絲比率的主次因素依次是D、A、B、C，即VC是主要影響因子，VB1、VB2和VB12次之。方差分析結(jié)果表明，僅有D因素即VC在α=0.05水平上對鎖狀聯(lián)合菌絲比率的影響存在顯著差異，因此，在黑木耳菌絲生長培養(yǎng)基中首先考慮的是添加VC。經(jīng)驗證試驗后等綜合方面考慮，維生素的添加最佳方案為D3A3B2C1，即VC0.18 μg/mL、VB10.28 μg/mL、VB20.20 μg/mL、VB120.12 μg/mL。

表1 正交試驗因素水平

表2 正交試驗結(jié)果

注：同列不同小寫字母表示不同組合間差異顯著(P<0.05)

Note：Different lowercases in the same column stand for significant differences between different combinations at 0.05 level

3 結(jié)論與討論

黑木耳菌絲的生長需要大量的碳源和氮源，不同碳源和氮源對菌絲生長有一定的影響[9-10]。趙萍[5]研究表明，適宜濃度的氨基酸(除酪氨酸)對黑木耳菌絲生長有促進作用，高濃度有抑制作用。而作為生長因子的維生素對黑木耳菌絲形成鎖狀聯(lián)合的研究很少。該研究發(fā)現(xiàn)，適宜濃度的VB1、VB2、VB12和VC對黑木耳菌絲形成鎖狀聯(lián)合均有促進作用，這也是生長因子促進菌絲生長的一個重要表現(xiàn)，與其他研究者關(guān)于維生素對食用菌菌絲生長影響的研究結(jié)果一致[11-13]。

通過正交試驗可以看出，多生長因子的加入對黑木耳鎖狀聯(lián)合形成有促進作用，鎖狀聯(lián)合菌絲比率達94.43%，高于單因子的作用，但作用效果不同。方差分析結(jié)果表明，在多因子作用中，只有VC作用效果顯著，VB1、VB2、VB12的效果未達到顯著水平，多種維生素加入的組合是VB10.28 μg/mL、VB20.20 μg/mL、VB120.12 μg/mL、VC0.18 μg/mL。因此，在黑木耳菌種制備過程中有必要考慮加入適量的維生素，以利于提高黑木耳子實體的產(chǎn)量。