袁樂梅，邊名鴻，李正濤，楊志陽，張雨

(1.四川理工學(xué)院 生物工程學(xué)院，四川 自貢 643000；2.釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 自貢 643000)

酸菜是我國人民喜愛的傳統(tǒng)蔬菜發(fā)酵制品，其口味多樣、味道酸爽、開胃醒酒，不僅能幫助消化、增進(jìn)食欲，還具有降低膽固醇和抗癌等功效[1]。酸菜汁液中含有多種功能性微生物，賦予了酸菜多種口感、營養(yǎng)和香氣[2]。不同地區(qū)的酸菜口味風(fēng)格相差較大，川西彝族傳統(tǒng)酸菜是在海拔1800 m的高寒地區(qū)制作出的特色酸菜，最終成菜是干酸菜，需煮食[3]。川西彝族傳統(tǒng)酸菜以圓根菜為主要原料，泡制過程中不添加鹽，避免了細(xì)胞因滲透壓過高而失水，發(fā)酵過程中也幾乎不產(chǎn)生亞硝酸鹽。由于其特殊的地理環(huán)境和獨(dú)特的制作工藝，形成了川西彝族傳統(tǒng)酸菜獨(dú)特的口感和香氣，同時其酸菜母汁中也富集了彝族高山地區(qū)特有的菌群，對其進(jìn)行深入的研究并且應(yīng)用于蔬菜發(fā)酵中，對提高人們的健康水平和開發(fā)新的發(fā)酵蔬菜品種有著重要的意義[4]。

川西彝族傳統(tǒng)酸菜制作過程獨(dú)特，在沒有鹽脅迫的環(huán)境中乳酸菌仍富集為優(yōu)勢菌，說明該菌群的繁殖能力及抑菌能力都較強(qiáng)。本研究擬從川西彝族傳統(tǒng)酸菜汁中篩選抑菌性較強(qiáng)的乳酸菌，并對篩選得到的菌種進(jìn)行鑒定及特性研究，以期將川西彝族傳統(tǒng)酸菜汁中的功能性微生物應(yīng)用于低鹽發(fā)酵蔬菜制品生產(chǎn)，為低鹽蔬菜發(fā)酵提供一定的菌種資源和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

樣品：川西彝族傳統(tǒng)酸菜汁，采自川西傳統(tǒng)彝族家庭。

試驗(yàn)菌株：大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)，由釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 試劑與培養(yǎng)基

PCR引物、Taq酶、10×緩沖液、dNTP：寶生物工程(大連)有限公司；瓊脂糖：北京索萊寶科技有限公司；Marker：上海英駿生物技術(shù)有限公司；其他試劑：均為分析純，購于成都市科龍化工試劑廠。

MRS分離培養(yǎng)基[5]：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母膏5 g，葡萄糖20 g，檸檬酸氫二銨2 g，磷酸氫二鉀2 g，硫酸鎂0.58 g，硫酸錳0.25 g，乙酸鈉5 g，吐溫-80 1 mL，碳酸鈣20 g，瓊脂20 g，加水定容至1000 mL，pH 6.2±0.2，滅菌待用。

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基[6]：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，氯化鈉5 g，瓊脂20 g，加水定容至1000 mL，pH 7.5左右，滅菌待用。

1.3 儀器與設(shè)備

PHS-2C精密pH計 上海虹益儀器儀表有限公司；WH-2微型旋渦混合儀 上海瀘西分析儀器廠有限公司；生化培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；756紫外可見分光光度計 上海奧譜勒儀器有限公司；DYY-12電泳儀 北京百晶生物技術(shù)有限公司；PCR儀和凝膠成像系統(tǒng) 美國Thermo公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 產(chǎn)酸乳酸菌的分離純化

吸取1 mL彝族傳統(tǒng)酸菜汁，用無菌水將其進(jìn)行逐級稀釋，制備10-1～10-99個梯度稀釋液。吸取各梯度的菌懸液200 μL涂布于MRS分離培養(yǎng)基上，于37 ℃恒溫培養(yǎng)24～48 h。挑取具有較大溶鈣圈的菌落，再在MRS分離培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，按溶鈣圈大小分類并做好標(biāo)記[7]。

1.4.2 復(fù)篩

將溶鈣圈大的乳酸菌以2%的接種量，分別接種到含有MRS液體培養(yǎng)基的離心管中，置于搖床中，37 ℃下培養(yǎng)24 h，12000 r/min離心8 min，取上清液備用。以生理鹽水代替待檢上清液為對照組，用牛津杯雙層平板擴(kuò)散法測定對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果[8,9]。量取抑菌圈直徑，根據(jù)抑菌圈直徑大小進(jìn)行復(fù)篩。

1.4.3 生長曲線和產(chǎn)酸特性分析[10]

以2%的接種量將復(fù)篩的乳酸菌接種于100 mL的MRS液體培養(yǎng)基中，于37 ℃生化箱中培養(yǎng)24 h，每隔2 h吸取菌液在600 nm處測定吸光值和pH值。以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，以A600為縱坐標(biāo)繪制生長曲線圖；以pH值為縱坐標(biāo)繪制產(chǎn)酸能力曲線圖。

1.4.4 耐受性實(shí)驗(yàn)

1.4.4.1 溫度耐受性

以2%的接種量將菌液接種于含有10 mL MRS液體培養(yǎng)基的試管中，分別于溫度25，27，29，31，33，35，37，39 ℃下培養(yǎng)24 h，每4 h在600 nm處測定吸光值，每組3個平行[11]。

1.4.4.2 pH耐受性

以2%的接種量將菌液接種于pH分別為2，3，4，5，6的含10 mL MRS液體培養(yǎng)基的試管中，于37 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，分別在600 nm處測定吸光值，各pH下的菌株做3組平行[12]。

1.4.4.3 鹽度耐受性

以2%的接種量將菌液接種于NaCl質(zhì)量濃度分別為0，4%，8%，12%，16%，20%，24%的含10 mL MRS液體培養(yǎng)基的試管中，于37 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，每隔4 h分別在600 nm處測定吸光值，各NaCl質(zhì)量濃度下的菌株做3組平行[13,14]。

1.4.5 乳酸菌16S rDNA分子生物學(xué)鑒定[15]

PCR引物的上游序列為27F：5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'，下游序列為1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。

PCR反應(yīng)體系(50 μL):10×緩沖液5 μL，dNTP 3 μL，引物27F和1492R各1 μL，Taq酶1 μL，模板3 μL，DDW 36 μL。

PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性4 min，95 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸90 s，30個循環(huán)后，72 ℃保留10 min；于10 ℃保存。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，于凝膠成像系統(tǒng)下觀察，可見約1500 bp條帶，送至上海生物生工測序有限公司成都分部進(jìn)行測序，將測序結(jié)果輸入NCBI，利用數(shù)據(jù)庫中的BLAST功能與已有的細(xì)菌16S rRNA基因序列進(jìn)行對比，選擇與測定菌株同源性高的已知菌種，利用Clustalx和MEGA等軟件，繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的分離和篩選

菌株的產(chǎn)酸量高低與溶鈣圈大小成正比，由此分離純化出41株產(chǎn)酸明顯的乳酸菌，接種于MRS液體培養(yǎng)基中發(fā)酵后取上清液，用牛津杯雙層平板擴(kuò)散法測定其對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌能力。發(fā)現(xiàn)6株菌株上清液對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有明顯的抑制作用，其抑菌圈均大于17 mm，見表1。

表1 6株菌對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌情況Table 1 6 strains' inhibition on E.coli and Staphylococcus aureus mm

2.2 形態(tài)特征

將具有較強(qiáng)抑菌能力的6株乳酸菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)的初步鑒定[16]。各菌株的菌落和菌體形態(tài)特征見表2和圖1。

表2 乳酸菌的形態(tài)學(xué)特征Table 2 The morphologic characteristics of Lactobacillus

圖1 部分菌株的菌落形態(tài)和顯微形態(tài)Fig.1 Colony and microscopic morphology of part strains

由表2和圖1可知，6株菌株菌落形態(tài)大致相同，菌落呈白色或乳白色，圓形，中央凸起，表面光滑濕潤，邊緣整齊；菌體形態(tài)呈短桿狀或球狀，無芽孢和鞭毛，單個或呈鏈狀，革蘭氏染色均呈陽性。

2.3 生長曲線及產(chǎn)酸特性分析

圖2 6株乳酸菌的生長曲線Fig.2 Growth curves of 6 strains of Lactobacillus

圖3 6株乳酸菌的產(chǎn)酸特性分析曲線Fig.3 The curves of acid production characteristics of 6 strains of Lactobacillus

由圖2和圖3可知，乳酸菌B1和B3具有類似的生長曲線，培養(yǎng)4 h后菌體大量繁殖，進(jìn)入對數(shù)生長期，14 h時菌體量達(dá)到最大，進(jìn)入穩(wěn)定期；乳酸菌A1和F1在培養(yǎng)2 h后進(jìn)入對數(shù)期，14 h時進(jìn)入穩(wěn)定期；乳酸菌C3在培養(yǎng)8 h左右時進(jìn)入對數(shù)期，14 h時進(jìn)入穩(wěn)定期；乳酸菌D2在培養(yǎng)14 h后菌體進(jìn)入對數(shù)期，20 h后進(jìn)入穩(wěn)定期。乳酸菌C3、D2和F1生長過程中pH值無較大變化；乳酸菌A1、B1和B3的pH值隨時間增加逐漸減小。pH值越低說明菌株產(chǎn)酸能力強(qiáng)，pH值變化小時產(chǎn)酸能力弱。其中，乳酸菌B1的產(chǎn)酸能力最強(qiáng)，發(fā)酵液的pH值共降低1.25；乳酸菌A1和B3的pH值分別降低1.02和1.11。低鹽發(fā)酵蔬菜中，乳酸菌的適應(yīng)期越短其繁殖能力越強(qiáng)，能盡快分離出有益物質(zhì)；乳酸菌的產(chǎn)酸能力決定了產(chǎn)品的風(fēng)味和口感，也在一定程度上延長了產(chǎn)品的貨架期，抑制了腐敗菌的生長，起到防腐的作用[17]。因此，選擇適應(yīng)期短、產(chǎn)酸能力強(qiáng)的乳酸菌作為生產(chǎn)用菌株。由此可知，在低鹽發(fā)酵蔬菜生產(chǎn)中，乳酸菌A1、B1和B3更具潛力。

2.4 耐受性分析

2.4.1 溫度耐受性

蔬菜發(fā)酵過程中，溫度通過影響生物大分子的功能特性、細(xì)胞結(jié)構(gòu)以及胞內(nèi)酶的活性等來影響微生物的生長和繁殖，張?zhí)m威[18]的研究表明較高的溫度有助于混合生長菌株的比例達(dá)到平衡。因此，選擇溫度耐受性高的菌株，有利于產(chǎn)品品質(zhì)和風(fēng)味的提升。

圖4 6株菌的溫度耐受性曲線Fig.4 Temperature resistance curves of 6 strains of Lactobacillus

由圖4可知，乳酸菌A1，B1，B3對溫度的耐受性較高，在溫度為39 ℃時仍能較好地生長。其余3株乳酸菌對溫度的耐受性較差。

2.4.2 pH耐受性

蔬菜發(fā)酵過程中，溶液酸度不斷增加，pH值逐漸降低。pH對乳酸菌的活性有很大的影響，過高酸度的條件下，乳酸菌的活性受到抑制，影響乳酸菌的生物酶活性以及細(xì)胞吸收和代謝的能力[19]。因此，研究乳酸菌對pH的耐受性，篩選出能在高酸性條件下生長的乳酸菌，以維持發(fā)酵的正常進(jìn)行。

圖5 6株乳酸菌的pH耐受性曲線Fig.5 pH resistance curves of 6 strains of Lactobacillus

由圖5可知，乳酸菌的生長繁殖能力隨著pH的增大而增強(qiáng)。pH在4～6時，6株乳酸菌均生長良好；而在pH為2～4時，乳酸菌的生長均受到不同程度的抑制。其中乳酸菌B1在高酸性環(huán)境下，表現(xiàn)出較好的pH耐受性。

2.4.3 鹽度耐受性

圖6 6株乳酸菌的耐鹽性曲線Fig.6 Salt resistance curves of 6 strains of Lactobacillus

由圖6可知，發(fā)酵的過程中，隨著鹽濃度的升高，6株乳酸菌的生長都受到了不同程度的抑制。但低鹽發(fā)酵蔬菜中鹽濃度都低于6%，因此選擇在0～8%鹽濃度范圍內(nèi)活性高的乳酸菌作為生產(chǎn)用菌株[20]。乳酸菌A1、B1、B3、C3在低鹽濃度下生長良好，較適合于生產(chǎn)發(fā)酵。

2.5 乳酸菌B1的16S rRNA序列分析結(jié)果

綜上試驗(yàn)結(jié)果，選擇生長迅速、產(chǎn)酸量高，對溫度、pH、鹽濃度的耐受性都較強(qiáng)的乳酸菌B1進(jìn)行分子學(xué)生物鑒定。電泳檢測結(jié)果顯示乳酸菌B1在約1500 bp之間有明顯的電泳條帶。

將乳酸菌B1的基因序列與數(shù)據(jù)庫中已有的細(xì)菌基因序列進(jìn)行比對，其序列與植物乳桿菌的同源性為100%。利用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖7。乳酸菌B1與植物乳桿菌的系統(tǒng)位置最為接近，與布氏乳桿菌和干酪乳桿菌等形成的同源簇有明顯的差異。因此，乳酸菌B1被鑒定為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)。

圖7 乳酸菌B1基于16S rRNA序列進(jìn)行構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.7 Phylogenetic tree of Lactobacillus B1 based on the 16S rRNA sequence

3 結(jié)論

川西彝族傳統(tǒng)酸菜作為具有民族特色的健康食品，被越來越多的人們所認(rèn)同，市場潛力大。然而對川西彝族傳統(tǒng)酸菜中功能微生物的研究近乎空白，因此，本文從川西彝族傳統(tǒng)酸菜汁中分離純化出產(chǎn)酸量較高的41株乳酸菌，經(jīng)抑菌實(shí)驗(yàn)，優(yōu)選出6株抑菌能力較強(qiáng)的乳酸菌，編號依次為A1、B1、B3、C3、D2、F1。為篩選得到適用于低鹽發(fā)酵蔬菜的乳酸菌，研究了6株菌的生長曲線以及產(chǎn)酸能力、溫度耐受性、pH耐受性和鹽度耐受性，最終選出綜合性能較好的乳酸菌B1，對其16S rRNA序列進(jìn)行分析，鑒定其為植物乳桿菌。通過一系列理化、耐受性分析發(fā)現(xiàn)乳酸菌B1是一株極具應(yīng)用潛力的菌株。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，可將其應(yīng)用于低鹽發(fā)酵蔬菜中，進(jìn)一步優(yōu)化發(fā)酵工藝條件。也可豐富發(fā)酵食品微生物，對推動民族食品的開發(fā)及工業(yè)化生產(chǎn)具有積極的意義。