于霞 羅晶晶 趙立平 徐洋 梁倩 馬異峰 董玲玲 黃海榮

作者單位：101149 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院 北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所 國(guó)家結(jié)核病臨床實(shí)驗(yàn)室 耐藥結(jié)核病研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(于霞、羅晶晶、趙立平、梁倩、馬異峰、董玲玲、黃海榮)；大連市友誼醫(yī)院腫瘤內(nèi)科(徐洋)

非結(jié)核分枝桿菌(non-tuberculous mycobacteria，NTM)廣泛存在于水、食品、土壤和灰塵中[1]。盡管被認(rèn)為是機(jī)會(huì)致病菌，但NTM病在全球范圍內(nèi)的發(fā)病率和患病率在過(guò)去幾十年中呈上升趨勢(shì)[2-4]。主要的致病性NTM對(duì)大多數(shù)抗生素天然耐藥的特點(diǎn)使其治療面臨著極大的挑戰(zhàn)[5]。雖然一些專業(yè)機(jī)構(gòu)已經(jīng)推薦了針對(duì)最流行NTM菌種引起的感染的治療方案[6]，但這些方案通常缺乏足夠的證據(jù)支持，并且治療結(jié)果也不太理想[7]。更讓人擔(dān)憂的是，在一線抗NTM治療方案失敗后基本沒(méi)有可選擇的替代方案。因此，迫切需要篩選新的抗NTM藥物，或是發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有藥物的抗NTM活性。

美羅培南(meropenem，MEM)是一種應(yīng)用廣泛的廣譜碳青霉烯類抗菌藥物，對(duì)于革蘭陰性和陽(yáng)性細(xì)菌均有較好的抑菌活性，廣泛應(yīng)用肺、腹腔、泌尿系統(tǒng)和軟組織等感染的治療。與傳統(tǒng)的β-內(nèi)酰胺類抗生素類抗不同，MEM與β-內(nèi)酰胺酶BalC的親和力較低，導(dǎo)致其在細(xì)菌內(nèi)不容易被水解，進(jìn)而發(fā)揮持續(xù)的抗菌效果。以往的研究表明，MEM對(duì)結(jié)核分枝桿菌有較好的體內(nèi)外抑菌活性[8-10]。本研究的目的主要是評(píng)價(jià)MEM對(duì)NTM標(biāo)準(zhǔn)株和常見(jiàn)的臨床分離株的體外抑菌活性，從而為臨床應(yīng)用MEM治療NTM病提供依據(jù)。

表1 MEM對(duì)30株RGM標(biāo)準(zhǔn)菌株和16株SGM標(biāo)準(zhǔn)菌株的MIC情況

材料與方法

1.標(biāo)準(zhǔn)菌株和臨床分離株：對(duì)首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院菌株庫(kù)中保存的所有分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行體外MEM藥敏試驗(yàn)，包括30種快速生長(zhǎng)的分枝桿菌(RGM)和16種緩慢生長(zhǎng)的分枝桿菌(SGM)，菌種的中文譯名依據(jù)《分枝桿菌菌種中文譯名原則專家共識(shí)》[11]。這些標(biāo)準(zhǔn)菌株購(gòu)自美國(guó)典型菌種保藏中心(ATCC)或德國(guó)微生物菌種保藏中心(DSM)。納入的標(biāo)準(zhǔn)菌株的種類組成見(jiàn)表1。收集首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院2015年1月至2016年12月分離的NTM臨床分離株，包括膿腫分枝桿菌40株，胞內(nèi)分枝桿菌36株，偶發(fā)分枝桿菌33株，鳥分枝桿菌22株，堪薩斯分枝桿菌45株，戈登分枝桿菌10株，其他菌種的NTM分離株21株，共計(jì)207株。其他21株NTM臨床分離株的種類和組成見(jiàn)表2。所有NTM臨床分離株通過(guò)對(duì)硝基苯甲酸生長(zhǎng)試驗(yàn)，以及16S rRNA、hsp65、rpoB 和 16-23S rRNA序列測(cè)定和分析比對(duì)，鑒定至菌種水平[12]。

2.最低抑菌濃度測(cè)定(minimal inhibitory concentration,MIC)：MEM購(gòu)自Sigma公司(美國(guó)),溶于二甲基亞砜(DMSO),存儲(chǔ)液濃度為2 mg/ml，保存于-80 ℃。參照臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)的指南進(jìn)行肉湯稀釋法藥敏試驗(yàn)[6]。SGM的藥敏試驗(yàn)采用含OADC(油酸-白蛋白-葡萄糖-過(guò)氧化氫酶)的Mueller Hinton(MH)肉湯培養(yǎng)基，RGM的藥敏試驗(yàn)采用不含OADC的MH肉湯培養(yǎng)基。取接種于羅氏培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的細(xì)菌進(jìn)行MIC測(cè)定。將MH肉湯培養(yǎng)基進(jìn)行2倍稀釋，MEM濃度范圍是0.5～64 μg/ml。將細(xì)菌稀釋后接種到96孔微孔板中，每孔的細(xì)菌載量約為105菌落形成單位(CFU)。之后，SGM和RGM分別在37 ℃培養(yǎng)7 d和 3 d后，每孔加入含20 μl Alamar Blue和50 μl吐溫80(5%)的混合液，在37 ℃下孵育24 h后進(jìn)行顯色評(píng)價(jià)。液體由藍(lán)色變成粉色或紫色表明有細(xì)菌生長(zhǎng)。MIC被定義為防止顏色從藍(lán)色變?yōu)榉奂t色的最低藥物濃度。有研究報(bào)道NTM對(duì)MEM耐藥的臨界值為8～16 μg/ml[6],本研究將MIC≤8 μg/ml的菌株定義為MEM敏感菌株。

注表中括號(hào)內(nèi)數(shù)值為“菌株數(shù)(株)”

結(jié) 果

1. MEM 對(duì)NTM標(biāo)準(zhǔn)菌株的MIC情況：30株 RGM標(biāo)準(zhǔn)菌株和16株SGM標(biāo)準(zhǔn)菌株的MEM的MIC情況見(jiàn)表1。MEM對(duì)RGM表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌活性。在30株RGM中，MEM對(duì)22株的MIC≤8 μg/ml,其中MEM對(duì)15株RGM的MIC≤2 μg/ml。在16株SGM菌株中，MEM的抗菌活性相對(duì)較差，有7株菌株的MIC≤8 μg/ml,其中6株菌株的MIC≤2 μg/ml,分別為戈登分枝桿菌(MIC=0.25 μg/ml), 胃分枝桿菌和蘇爾加分枝桿菌(MIC=0.5 μg/ml),不產(chǎn)色分枝桿菌(MIC=1 μg/ml),田鼠分枝桿菌(MIC=2 μg/ml)，結(jié)核分枝桿菌(MIC=2 μg/ml)。

2. MEM對(duì)臨床常分離到的NTM菌種的MIC分布情況: MEM對(duì)6種臨床常分離到的NTM的MIC分布情況如圖1所示。MEM對(duì)偶發(fā)分枝桿菌有較好的體外抑菌活性，而對(duì)膿腫分枝桿菌抑菌活性較差。在33株偶發(fā)分枝桿菌中,MEM耐藥率為33.3%(11/33)，其中5株菌株的MIC>64 μg/ml。在40株膿腫分枝桿菌中,MEM耐藥率為82.5%(33/40)，僅有6株菌株的MIC≤2 μg/ml。22株鳥分枝桿菌中, MEM的耐藥率為72.7%(16/22)，僅有3株菌株的MIC≤2 μg/ml。在36株胞內(nèi)分枝桿菌中, MEM耐藥率為63.9%(23/36)，僅有8株菌株的MIC≤2 μg/ml。45株堪薩斯分枝桿菌臨床分離株中僅有2株菌株的MIC≤8 μg/ml,其余菌株均對(duì)MEM耐藥。10株戈登分枝桿菌臨床分離株中,MEM的耐藥率為20.0%(2/10)，有7株菌株的MIC≤2 μg/ml。

3.MEM對(duì)臨床分離株數(shù)較少的NTM菌種的體外抑菌活性: MEM對(duì)不常見(jiàn)的NTM臨床分離株的體外抑菌活性見(jiàn)表2。MEM對(duì)納入非常見(jiàn)NTM的體外抑菌活性較弱，僅對(duì)1株阿羅普分枝桿菌，1株龜分枝桿菌和1株瑪爾摩分枝桿菌敏感,MIC值分別為0.5 μg/ml、0.25 μg/ml和8 μg/ml。

討 論

隨著NTM診斷技術(shù)的不斷發(fā)展以及臨床醫(yī)生對(duì)NTM病的重視，NTM病的流行率也在逐年攀升[3-4, 13-14]。因此，研發(fā)新的抗NTM藥物或者發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有抗生素的抗NTM活性，對(duì)于NTM病的治療非常重要。β-內(nèi)酰胺酶類抗生素是最早應(yīng)用于臨床治療的抗生素，包括青霉素類，頭孢菌素類以及碳青霉烯類。研究已經(jīng)證實(shí)在所有β-內(nèi)酰胺酶類抗生素中，碳青霉烯類對(duì)耐多藥結(jié)核分枝桿菌體外抑菌效果最好[15]。關(guān)于MEM對(duì)NTM體外抑菌活性的研究較少，目前推薦的各種NTM感染治療方案中尚不包括MEM。本研究評(píng)價(jià)了MEM對(duì)NTM標(biāo)準(zhǔn)株和臨床分離株的體外抑菌活性，這些研究將為MEM在NTM病中的治療提供依據(jù)。

本研究中不同的NTM菌種表現(xiàn)出對(duì)MEM不同的藥物敏感性。在30株RGM菌株中，26.7%(8/30)菌株對(duì)MEM耐藥。而偶發(fā)分枝桿菌和膿腫分枝桿菌的臨床分離株對(duì)MEM的耐藥率分別為33.3%(11/33)和82.5%(33/40)。與RGM相比，MEM對(duì)SGM的抗菌活性相對(duì)較差。16株SGM標(biāo)準(zhǔn)株中有9株56.3%(9/16)對(duì)MEM耐藥。在SGM 臨床株中戈登分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌、鳥分枝桿菌和堪薩斯分枝桿菌對(duì)MEM的耐藥率分別依次為20.0%(2/10)、63.9%(23/36)、72.7%(16/22)和95.6%(43/45)。目前，關(guān)于MEM對(duì)NTM菌株的體外抑菌活性的研究較少，且部分結(jié)果不一致。Li等[5]研究證實(shí)了MEM對(duì)偶發(fā)分枝桿菌和戈登分枝桿菌具有較好的抑菌效果，但對(duì)鳥胞內(nèi)分枝桿菌的體外抑菌效果較差，與本研究結(jié)果一致。同時(shí)，該研究認(rèn)為膿腫分枝桿菌對(duì)MEM的耐藥率為43.3%(23/53)，而本研究的耐藥率為82.5%(33/40)。Brown-Elliott等[16]研究證實(shí)了MEM對(duì)膿腫復(fù)合群的耐藥率為87.9%(58/66)，與本研究的結(jié)果比較一致。因此，仍需要更多的研究來(lái)明確MEM對(duì)NTM的體外抑菌活性。

MEM屬于時(shí)間依賴型抗菌藥物，其發(fā)揮抗菌活性需要一定的濃度并維持較長(zhǎng)的時(shí)間，T>MIC 反應(yīng)了細(xì)菌與抗菌藥物接觸時(shí)間對(duì)藥物效果的影響，能較好地預(yù)測(cè)其臨床療效。因此，根據(jù)MEM的藥代動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)，只有MIC<16 μg/ml的細(xì)菌，通過(guò)優(yōu)化MEM的給藥方案可以達(dá)到滿意的治療效果[17]。CLSI推薦的MEM的耐藥臨界值為8～16 μg/ml，此時(shí)，MEM血藥濃度恰好可以抑制敏感細(xì)菌的生長(zhǎng)。另外，一系列的研究結(jié)果證明了在結(jié)核分枝桿菌中，MEM聯(lián)合β-內(nèi)酰胺酶抑制劑，可以進(jìn)一步將MEM對(duì)細(xì)菌的MIC降低[10, 15]，其中以聯(lián)合舒巴坦應(yīng)用效果最好。因此，對(duì)于一些MEM體外抑菌活性較好的NTM菌種，在制定方案時(shí)可以考慮聯(lián)合應(yīng)用β-內(nèi)酰胺酶抑制劑以期達(dá)到更好的治療效果。

綜上所述，MEM對(duì)于大多數(shù)RGM菌種和部分SGM菌種具有較好的體外抑菌活性。在臨床上常見(jiàn)的NTM致病菌株中，MEM對(duì)偶發(fā)分枝桿菌和戈登分枝桿菌具有較好的體外抑菌活性。本研究為臨床合理應(yīng)用MEM治療NTM病提供了依據(jù)。