張曉紅，宋彩麗，殷惠軍，尹淑琴，常 泓

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太谷030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)期刊社，山西太谷030801）

UK114（山羊肝臟腫瘤抗原）蛋白是鈣激活蛋白酶激活蛋白，是μ-calpain的激活蛋白，UK114蛋白是一種低分子量的保守蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)廣泛存在于真核和原核類生物中[1]。在UK114蛋白質(zhì)家族中大約有200多個(gè)同源物，表明此類蛋白質(zhì)在生物體內(nèi)起著重要的作用[2]。

UK114是UK101蛋白組成之一。分子量約為14 ku。UK101是BARTORELLI等[3]在 1994年從山羊肝臟中發(fā)現(xiàn)的一種高氯酸可溶性蛋白，這種蛋白是抗原性的，研究發(fā)現(xiàn)，該蛋白質(zhì)具有抗腫瘤活性。UK101主要由3種不同大小分子量的蛋白質(zhì)構(gòu)成：UK110，分子量大小為10 ku；UK114，分子量大小約為14 ku；UK150，分子量大小為50 ku，是富含甘露糖的蛋白質(zhì)[4-5]。MELLONI等[6-7]研究發(fā)現(xiàn)，UK114 蛋白是calpain-1的激活蛋白；PONTREMOLI等[8]對(duì)該蛋白的氨基酸順序進(jìn)行了測(cè)定。朱宏等[9-10]在山羊肝臟中克隆了UK114蛋白基因，研究了它在肉嫩化機(jī)理中的作用。在UK114蛋白家族中，尤其是DUK114（果蠅體內(nèi)UK114的同源物）蛋白，它的結(jié)構(gòu)是保守的，且其功能是由其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)決定的[11-12]。FARKAS等[11]研究表明，DUK114是一種分子伴侶，它與Hsp90有相似的功能。CSERMELY等[12]研究推測(cè)，DUK114蛋白的調(diào)控是發(fā)生在蛋白質(zhì)水平，而不是細(xì)胞水平。

蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)中功能的主要承擔(dān)者，為此，本研究對(duì)該類蛋白質(zhì)進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，主要是對(duì)其蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、亞細(xì)胞定位、蛋白質(zhì)互作關(guān)系以及蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)[13]。由于蛋白質(zhì)的種類繁多，一些技術(shù)不能普遍使用，生物信息學(xué)的出現(xiàn)，為蛋白質(zhì)二、三級(jí)結(jié)構(gòu)的獲得提供了捷徑[14-15]。之前大多都是研究這些基因的結(jié)構(gòu)和功能，對(duì)蛋白質(zhì)的研究相對(duì)較少。

本研究通過從山羊肝臟中提取總RNA，經(jīng)RT-PCR獲得目的基因，利用生物信息學(xué)分析技術(shù)，對(duì)其編碼的蛋白序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，從而更加清楚地了解其產(chǎn)生功能的機(jī)制，為其奠定理論基礎(chǔ)，也為后期深入研究UK114蛋白結(jié)構(gòu)功能等研究提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 材料 將新鮮的山羊肝臟組織（取自山西省太谷縣范村），用剪刀剪成數(shù)塊，用錫箔紙包好，置于液氮罐中帶回，放到-80℃冰箱保存。

1.1.2 試劑 總RNA抽提試劑盒，RT-PCR試劑盒，DNA Marker 2 000，Taq DNA 聚合酶，dNTP，瓊脂糖，均購(gòu)自索萊寶公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 參考GenBank提供的山羊UK114核酸序列，使用Primer 5.0在線軟件設(shè)計(jì)引物，由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成，序列如下。

正向：5′-AAGGATCCATGTCGTCTTTGG-3′；反向：5′-GAACTCGAGTTAGAGTGATGCTGTC-3′。

1.2.2 總RNA抽提與RT-PCR 使用總RNA提取試劑盒提取總RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA濃度，使用RT-PCR試劑盒對(duì)RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)體系為 50 μL：ddH2O 為 36.5 μL，10×PCR Buffer為 5 μL，dNTPS 為 1 μL，引物 1 為1 μL，引物 2 為 1μL，Taq酶為 0.5 μL，反轉(zhuǎn)錄 cDNA為5μL。

PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性2 min；94℃高溫變性30 s，55℃低溫退火30 s，72℃延伸 1 min，30個(gè)循環(huán)；然后72℃延伸5 min，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，使用膠回收試劑盒進(jìn)行膠回收純化，送去生工公司測(cè)序。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 本次試驗(yàn)中生物信息學(xué)分析均采用網(wǎng)上在線軟件，即運(yùn)用ExPasy-Prot-Param在線軟件分析蛋白質(zhì)的基本理化性質(zhì)；運(yùn)用SignalP 4.1 Server，ExPASY-ProtScale分別進(jìn)行蛋白質(zhì)信號(hào)肽預(yù)測(cè)和疏水性分析；運(yùn)用NetPhos 3.1 server，Prosite在線軟件分析其磷酸化位點(diǎn)，運(yùn)用NetNGlyc 1.0 Server，NetNGlyc 4.0 Server在線軟件分析N-糖基化位點(diǎn)和O-糖基化位點(diǎn)；運(yùn)用SOMPA，SWISS-MODEL分別對(duì)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 RT-PCR結(jié)果分析

使用總RNA提取試劑盒提取總RNA后，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA濃度，使用RT-PCR試劑盒對(duì)RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增，再用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，該克隆目的基因約為414 bp，與預(yù)期結(jié)果一致。其中泳道1，2，3號(hào)條帶顏色較淺，說明DNA濃度較低，4，5號(hào)泳道條帶較亮，符合進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)要求。

2.2 UK114基因測(cè)序及編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)分析

測(cè)序結(jié)果如圖2所示，該基因序列的長(zhǎng)度為414 bp，編碼137個(gè)氨基酸。

使用ExPasy-ProtParam軟件分析該基因編碼的蛋白質(zhì)理化性質(zhì)，結(jié)果表明，該蛋白由137個(gè)氨基酸殘基組成，分子量約14.3 ku；理論等電點(diǎn)為6.19。由表1可知，UK114蛋白質(zhì)氨基酸序列中丙氨酸（Ala）含量最高，占到15.3%；其次是纈氨酸（Val），占到10.2%；組成蛋白質(zhì)的20種氨基酸中不含組氨酸（His）和色氨酸（Trp）。

表1 UK114蛋白質(zhì)氨基酸含量

2.3 蛋白質(zhì)疏水性、磷酸化位點(diǎn)和模體分析

氨基酸標(biāo)度是給每種氨基酸指定的數(shù)值，如分子質(zhì)量、密碼子數(shù)等，Hphob./Kyte&Doolittle代表氨基酸指定的數(shù)值，可測(cè)定蛋白質(zhì)的親疏水性。如圖3所示，該蛋白親水性最強(qiáng)區(qū)域在90～100，疏水性最強(qiáng)區(qū)域在80左右。

蛋白質(zhì)的磷酸化主要發(fā)生在絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸殘基上。經(jīng)NetPhos 3.1-磷酸化位點(diǎn)分析，如圖4所示，有7個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)，其中包括4個(gè)絲氨酸位點(diǎn)和2個(gè)蘇氨酸位點(diǎn)。蛋白質(zhì)模體也成為保守結(jié)構(gòu)域，蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域決定了蛋白質(zhì)在進(jìn)化上的穩(wěn)定性，與蛋白質(zhì)功能密切相關(guān)，對(duì)了解一個(gè)蛋白質(zhì)很重要。從圖5可以看出，該蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域位于C端，第105～123個(gè)氨基酸之間。

2.4 蛋白質(zhì)信號(hào)肽及糖基化預(yù)測(cè)

信號(hào)肽作為重要的細(xì)胞因子起作用，如圖6所示，Signal-IP信號(hào)肽預(yù)測(cè)，最大c值（cleavage site score，剪切位置分值）為0.169，最大s值（signal peptide score，信號(hào)肽分值）為0.183，最大y值（combined cleavage sitescore）為 0.155；從圖 6 還可以看出，UK114蛋白沒有信號(hào)肽。如圖7所示，經(jīng)過NetNGlyc1.0 Sever-N-糖基化位點(diǎn)分析表明，重組UK114蛋白沒有糖基化位點(diǎn)。

2.5 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

使用SOPMA軟件對(duì)UK114蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果如圖8所示，該蛋白質(zhì)由35.04%的α螺旋（Hh）、37.23%的無規(guī)則卷曲（Cc）、21.17%的 β折疊（Ee）和6.57%的β轉(zhuǎn)角（Tt）組成。其中，α螺旋和無規(guī)則卷曲為主要結(jié)構(gòu)，β轉(zhuǎn)角含量相對(duì)較少。

2.6 蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)，對(duì)其功能研究、細(xì)胞組織中定位、藥物設(shè)計(jì)等方面有著重要的作用。由圖9可知，α螺旋主要位于N端，β折疊主要位于C端，上邊已知保守區(qū)域在氨基酸的C端。因此，推測(cè)該蛋白的功能區(qū)域主要位于N端的α螺旋區(qū)域。

3 結(jié)論與討論

蛋白質(zhì)中氨基酸的排列順序決定了蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)，一級(jí)結(jié)構(gòu)決定了高級(jí)結(jié)構(gòu)，高級(jí)結(jié)構(gòu)決定了蛋白質(zhì)的具體功能，所以蛋白質(zhì)的功能與氨基酸的排列順序密不可分。蛋白質(zhì)中氨基酸不同種類的含量決定了氨基酸的親疏水性，也決定了蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，所以是否含有特征性的氨基酸對(duì)了解蛋白質(zhì)的功能起決定性的作用。本研究獲得一段完整的開放閱讀框基因序列，由414個(gè)核苷酸組成，可以編碼137個(gè)氨基酸，分子量為14 ku，等電點(diǎn)為6.19，整體偏弱酸性；氨基酸序列中丙氨酸含量最高。

蛋白質(zhì)的疏水性對(duì)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性、構(gòu)象和蛋白質(zhì)功能具有重要意義[17]。信號(hào)肽的作用是為了保證其在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中完成初步的N－連接糖基化修飾以及折疊[18]，糖基化對(duì)蛋白質(zhì)有重要的修飾作用，可以影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，也可以增強(qiáng)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性[19]，蛋白質(zhì)糖基化修飾中N－連接糖基化修飾是最常見的蛋白糖基化修飾[20]，該蛋白中沒有信號(hào)肽，可能因此導(dǎo)致也沒有糖基化位點(diǎn)，所以該蛋白穩(wěn)定性不高，這可能會(huì)給后續(xù)試驗(yàn)帶來一定的難度。蛋白質(zhì)的磷酸化和去磷酸化在生物體蛋白質(zhì)翻譯后修飾體系中起著非常重要的作用[21]，本蛋白有23個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中，絲氨酸和蘇氨酸位點(diǎn)較多，因此，它可能參與細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、分裂等生理生化過程。

認(rèn)識(shí)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)是了解蛋白質(zhì)的折疊模式和三級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)，并為研究蛋白質(zhì)的功能以及它們之間的相互作用模式提供結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[22]，預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)結(jié)果顯示，α螺旋占到了35.04%，不規(guī)則卷曲占到37.23%，β折疊占13.14%。蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)可以指導(dǎo)藥物設(shè)計(jì)、組織定位及功能研究等各個(gè)方面的工作[23]。本研究用SWISSMODEL在線軟件對(duì)UK114的氨基酸進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，結(jié)果表明，N端主要是α螺旋，C端主要是β折疊，保守區(qū)域也在氨基酸的C端。因此推測(cè)該蛋白的功能區(qū)域主要位于N端的α螺旋區(qū)域，在之后的研究中可將研究重點(diǎn)放到對(duì)α螺旋的研究上。