王 棟 白雪蕾 吳環(huán)立△

南陽(yáng)市第二人民醫(yī)院 1)神經(jīng)外科一病區(qū) 2)心臟生理實(shí)驗(yàn)室，河南 南陽(yáng) 473012

膠質(zhì)瘤是最常見(jiàn)的原發(fā)性顱內(nèi)惡性腫瘤，具有惡性程度高、易復(fù)發(fā)、預(yù)后差的特點(diǎn)[1-8]。目前臨床仍缺乏有效的治療方案，免疫療法作為近年來(lái)腫瘤領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，為改善膠質(zhì)瘤患者預(yù)后提供了新希望[9-15]。研究發(fā)現(xiàn)，免疫耐受和免疫逃逸在膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[15-21]。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是表達(dá)CD4、CD25、FOXP3的免疫負(fù)調(diào)節(jié)T細(xì)胞，參與免疫耐受和免疫逃逸的調(diào)節(jié)過(guò)程[22-28]。 IL-6、TGF-β1為細(xì)胞免疫抑制因子，在腫瘤微環(huán)境中由癌細(xì)胞分泌，抑制體內(nèi)免疫殺傷作用，促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖、遷移和轉(zhuǎn)移[29-30]。本研究通過(guò)檢測(cè)初發(fā)和復(fù)發(fā)膠質(zhì)瘤組織中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、IL-6、TGF-β1的表達(dá)水平，探討其與膠質(zhì)瘤病理分級(jí)和病情復(fù)發(fā)的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1．1研究對(duì)象選取2016-06-2017-10南陽(yáng)市第二人民醫(yī)院神經(jīng)外科收治的膠質(zhì)瘤患者24例，膠質(zhì)瘤初發(fā)時(shí)及術(shù)后病情復(fù)發(fā)均在南陽(yáng)市第二人民醫(yī)院行手術(shù)治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并全身性炎癥反應(yīng)、自身免疫性疾病患者。男14例，女10例；年齡5～77(41.35±10.69)歲；復(fù)發(fā)間隔時(shí)間(11.04±3.61)個(gè)月。取患者2次術(shù)后組織標(biāo)本共48份，分為初發(fā)組、復(fù)發(fā)組；根據(jù)世界衛(wèi)生組織2016年頒布的中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類與分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病理分級(jí)：Ⅰ級(jí)6例次，Ⅱ級(jí)14例次，Ⅲ級(jí)17例次，Ⅳ級(jí)11例次，其中Ⅰ級(jí)和Ⅱ級(jí)為低級(jí)別膠質(zhì)瘤，Ⅲ級(jí)和Ⅳ級(jí)為高級(jí)別膠質(zhì)瘤。另取同期腦外傷減壓手術(shù)切除的正常腦組織標(biāo)本6份為對(duì)照組。上述腦組織標(biāo)本術(shù)中切除后，在1.5 h內(nèi)分為2份，其中1份放入液氮中凍存，用于蛋白提取，另1份常規(guī)進(jìn)行石蠟包埋。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者或其家屬簽署知情同意書(shū)。

1．2免疫組化染色取腦組織石蠟包塊，4 μm連續(xù)切片，脫蠟至水，3% H2O2消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，枸櫞酸鹽修復(fù)抗原30 min，室溫下冷卻，滴加正常山羊血清封閉10 min，分別加一抗：小鼠抗人IL-6單克隆抗體(1：500稀釋)、兔抗人TGF-β1多克隆抗體(1：200稀釋)，4 ℃孵育過(guò)夜；滴加HRP標(biāo)記的二抗，室溫靜置30 min，DAB顯色、蘇木素復(fù)染、脫水、封片。另取組織切片重復(fù)上述操作至正常山羊血清封閉10 min后，滴加一抗：兔抗人FOXP3單克隆抗體(1：100稀釋)、小鼠抗人CD4細(xì)胞核抗體(1：100稀釋)4 ℃孵育過(guò)夜；分別滴加磷酸酶及HRP標(biāo)記的二抗，室溫靜置30 min，雙染DAB顯色，無(wú)菌蒸餾水終止反應(yīng)，雙染AP-Red再次顯色，蘇木素復(fù)染、脫水、封片。用磷酸緩沖液代替一抗作陰性對(duì)照，淋巴結(jié)組織切片作陽(yáng)性對(duì)照。結(jié)果判定：調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(CD4+FOXP3+)陽(yáng)性為細(xì)胞漿紅色、細(xì)胞核棕黃色；IL-6、TGF-β1陽(yáng)性為細(xì)胞漿棕黃色。光學(xué)顯微鏡高倍鏡視野下隨機(jī)選取10個(gè)視野進(jìn)行觀察、拍照，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞比例，以100個(gè)細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)表示。

1．3酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)取膠質(zhì)瘤組織和正常腦組織經(jīng)組織勻漿后取上清液，BCA法進(jìn)行蛋白定量，調(diào)整組織上清液中總蛋白含量相同，分別取100 μL上清液，使用IL-6、TGF-β1酶聯(lián)免疫吸附試劑盒測(cè)定含量，嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作。

2 結(jié)果

2．1膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)前后病理級(jí)別分布情況比較24例膠質(zhì)瘤患者病情復(fù)發(fā)后病理級(jí)別較初發(fā)時(shí)明顯增加，其中復(fù)發(fā)組Ⅲ級(jí)和Ⅳ級(jí)患者比例明顯高于初發(fā)組，Ⅰ級(jí)和Ⅱ級(jí)患者比例明顯低于初發(fā)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2．2調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在膠質(zhì)瘤組織切片中的表達(dá)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在膠質(zhì)瘤組織中呈散在浸潤(rùn)，病理分級(jí)Ⅰ～Ⅳ級(jí)的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞陽(yáng)性率分別為(2.48±0.51)%、(4.37±1.42)%、(7.69±1.13)%、(10.93±2.50)%，隨病理分級(jí)的增加，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞陽(yáng)性率明顯提升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。其中復(fù)發(fā)組調(diào)節(jié)性T細(xì)胞陽(yáng)性率為(8.81±1.75)%，明顯高于初發(fā)組的(5.38±1.42)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

2．3 IL-6、TGF-β1在膠質(zhì)瘤組織切片中的表達(dá)情況IL-6、TGF-β1在膠質(zhì)瘤組織中呈團(tuán)簇狀分布，病理分級(jí)Ⅰ～Ⅳ級(jí)的IL-6陽(yáng)性率分別為(7.24±1.42)%、(13.90±1.85)%、(19.71±2.13)%、(25.35±2.43)%；TGF-β1陽(yáng)性率分別為(3.51±0.64)%、(6.94±0.79)%、(8.55±0.93)%、(12.07±1.42)%。隨病理分級(jí)的增加，IL-6、TGF-β1陽(yáng)性率均明顯提升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。其中復(fù)發(fā)組IL-6、TGF-β1陽(yáng)性率明顯高于初發(fā)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖2、圖3、表2。

2．4各組腦組織勻漿中IL-6、TGF-β1濃度比較初發(fā)組與復(fù)發(fā)組的膠質(zhì)瘤組織勻漿中IL-6、TGF-β1濃度明顯高于對(duì)照組，復(fù)發(fā)組IL-6、TGF-β1濃度明顯高于初發(fā)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表3。

表1 膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)前后病理級(jí)別分布情況比較 [n(%)]

注：與初發(fā)組相比，aP<0.05

表2 初發(fā)組與復(fù)發(fā)組IL-6、TGF-β1表達(dá)陽(yáng)性率比較 (%)

注：與初發(fā)組相比，aP<0.05

圖1 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)情況(DAB、AP-Red染色，×400) A：Ⅰ級(jí)膠質(zhì)瘤；B：Ⅱ級(jí)膠質(zhì)瘤；C：Ⅲ級(jí)膠質(zhì)瘤；D：Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤Figure 1 The expression of regulatory T cells in glioma tissues (DAB，AP-Red staining，×400) A：Grade I glioma；B：Grade II glioma；C：Grade III glioma；D：Grade IV glioma

圖2 IL-6在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)情況(DAB染色，×400) A：Ⅰ級(jí)膠質(zhì)瘤；B：Ⅱ級(jí)膠質(zhì)瘤；C：Ⅲ級(jí)膠質(zhì)瘤；D：Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤Figure 2 The expression of IL-6 in glioma tissue (DAB staining，×400) A：Grade I glioma；B：Grade II glioma；C：Grade III glioma；D：Grade IV glioma

圖3 TGF-β1在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)情況(DAB染色，×400) A：Ⅰ級(jí)膠質(zhì)瘤；B：Ⅱ級(jí)膠質(zhì)瘤；C：Ⅲ級(jí)膠質(zhì)瘤；D：Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤Figure 3 The expression of TGF-beta 1 in glioma tissue (DAB staining，×400) A：Grade I glioma；B：Grade II glioma；C：Grade III glioma；D：Grade IV glioma

組別nIL6(pg/mL)TGFβ1(ng/mL)對(duì)照組62.38±0.111.14±0.06初發(fā)組2442.16±18.29 a8.42±1.49 a復(fù)發(fā)組2487.92±26.15 ab14.29±2.83 ab

注：與對(duì)照組相比，aP<0.01；與初發(fā)組相比，bP<0.01

3 討論

膠質(zhì)瘤是最常見(jiàn)的原發(fā)性中樞系統(tǒng)腫瘤，約占所有原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤的一半，具有惡性程度高、易復(fù)發(fā)的特點(diǎn)，患者5 a生存率低于10%。目前研究認(rèn)為，免疫耐受和免疫逃逸是膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展的主要機(jī)制。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可通過(guò)多種炎癥因子抑制樹(shù)突狀細(xì)胞成熟和抗原呈遞，阻止殺傷性T細(xì)胞活化，促進(jìn)免疫耐受和免疫逃逸。本研究顯示，膠質(zhì)瘤微環(huán)境中存在調(diào)節(jié)性T細(xì)胞高表達(dá)，且隨病理分級(jí)的增加而提升；膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)時(shí)的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞水平明顯高于初發(fā)時(shí)。提示調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可作為預(yù)測(cè)膠質(zhì)瘤惡變和復(fù)發(fā)的免疫指標(biāo)。

研究發(fā)現(xiàn)，IL-6作為腫瘤生長(zhǎng)因子的同時(shí)也是免疫抑制因子，下調(diào)IL-6表達(dá)后可有效抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。TGF-β1在腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲過(guò)程中發(fā)揮重要作用，能夠調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的擴(kuò)增和誘導(dǎo)生成，當(dāng)TGF-β1被特異性抗體阻斷后，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞水平明顯下降，機(jī)體免疫應(yīng)答提升。相關(guān)研究顯示，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中浸潤(rùn)增加，IL-6、IL-10、TGF-β1等細(xì)胞因子在其中發(fā)揮輔助作用。本研究顯示，膠質(zhì)瘤微環(huán)境中存在IL-6、TGF-β1高表達(dá)，且隨病理分級(jí)的增加而提升；膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)時(shí)的IL-6、TGF-β1水平明顯高于初發(fā)時(shí)。進(jìn)一步比較正常腦組織與膠質(zhì)瘤組織勻漿中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、IL-6、TGF-β1的濃度發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)瘤組織勻漿IL-6、TGF-β濃度明顯高于正常腦組織，且復(fù)發(fā)組濃度明顯高于初發(fā)組，提示IL-6、TGF-β在膠質(zhì)瘤發(fā)生、惡變、復(fù)發(fā)中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用，可用于膠質(zhì)瘤的免疫治療和預(yù)后判斷。