王嬌 齊沛沛 劉真真 孫宇涵 汪志威 王祥云 徐浩 狄珊珊 王強 王新全

摘?要?建立了土壤中43種農(nóng)藥及代謝物殘留的高通量分析方法。土壤樣品經(jīng)乙腈超聲萃取后，采用分散固相萃取法進一步對萃取液進行凈化。選擇修飾N-丙基乙二胺（PSA）的Fe3O4磁納米材料和C18為分散凈化吸附劑，采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）分析。優(yōu)化實驗結(jié)果表明，超聲萃取時間為10 min、凈化吸附劑Fe3O4-PSA用量為40 mg、C18用量為30 mg時，農(nóng)藥的回收率最佳。除3-羥基克百威和水胺硫磷（5～250 μg/L）外，各農(nóng)藥在2～250 μg/L范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（R）均大于0.9700，檢出限為0.1～1.0 μg/L。在10、100和200 μg/kg的添加濃度下，目標(biāo)分析物在土壤中的回收率在74.1%～120.0%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差≤18.1%。本方法前處理過程簡單，靈敏度高，凈化效果好，適用于土壤中多農(nóng)藥殘留分析。

關(guān)鍵詞?土壤; 磁分散固相萃取; 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜; 多農(nóng)藥殘留

1?引 言

目前，由于農(nóng)藥的過量使用和不規(guī)范使用，施用于農(nóng)田中的農(nóng)藥約有70%進入土壤[1]。殘留在土壤中的農(nóng)藥會隨著外界環(huán)境的變化而不斷釋放，經(jīng)各種介質(zhì)進入人體和動植物組織中，危害人類健康安全[2，3]。因此，有效監(jiān)控土壤中農(nóng)藥殘留情況對環(huán)境安全以及保護人類健康具有重要意義。

土壤基質(zhì)復(fù)雜，含有機酸、土壤微生物和金屬離子等雜質(zhì); 此外，土壤中的殘留農(nóng)藥種類多、濃度低，增加了測定難度，所以，在樣品前處理環(huán)節(jié)中有效去除基體雜質(zhì)的干擾至關(guān)重要[4]。傳統(tǒng)的土壤中農(nóng)藥殘留的提取方法主要有索氏提取、微波、超聲等輔助萃取等，凈化方法主要有固相萃取、層析法等[5～8]，但這些方法操作繁瑣、耗時長。QuEChERS（Quick， easy， cheap， effective， rugged and safe）方法采用溶劑萃取-分散固相萃取相結(jié)合，具有操作快速、便捷、成本低等優(yōu)勢，在土壤多農(nóng)藥殘留分析中應(yīng)用廣泛[9]。該方法操作過程中需兩次離心，相分離過程限制了樣品批處理速度。

磁納米材料因其高吸附性、超順磁性、易修飾和可磁分離等獨特優(yōu)勢，得到廣泛關(guān)注[10，11]。但磁性Fe3O4在酸、堿性條件下穩(wěn)定性不佳，且不具有吸附選擇性，對其進行功能化修飾，可提高穩(wěn)定性和選擇性吸附功能。在農(nóng)藥殘留分析中，功能化修飾的磁納米材料更多地被用于樣品中靶標(biāo)化合物的選擇性吸附，如Gao等[12]制備了Fe3O4/SiO2/p（MAA-co-EGDMA）用于吸附牛奶中磺胺類藥物。該類方法的優(yōu)勢是選擇性強，吸附效果好，但適用目標(biāo)分析物種類有限，缺乏普適性。借鑒QuEChERS方法中反相凈化的思路，選擇可以有效去除基體雜質(zhì)的吸附劑，而保留靶標(biāo)化合物在分散液體系中，更適合于多種農(nóng)藥殘留。目前，基于磁納米材料構(gòu)建農(nóng)藥殘留高通量樣品前處理技術(shù)的研究仍處于起步階段， Peng等[13]將ZrO2@Fe3O4用于分析魚肉中的有機氯類農(nóng)藥殘留，Qi等[14]利用Fe3O4-PSA NPs分析果蔬中多農(nóng)藥殘留。但目前尚無采用磁納米材料為分散固相萃取吸附劑分析土壤中的多農(nóng)藥殘留的研究報道。

本研究利用磁納米材料快速分離的優(yōu)勢， 根據(jù)目標(biāo)農(nóng)藥的結(jié)構(gòu)特點，選用乙腈為萃取劑，采用超聲萃取，實現(xiàn)靶標(biāo)化合物的充分提取。針對土壤基質(zhì)特點，選擇可去除弱極性化合物的Fe3O4-PSA與具有吸附非極性物質(zhì)能力的C18作為分散固相萃取吸附劑，去除土壤基質(zhì)中的干擾物質(zhì)。優(yōu)化了超聲萃取時間和兩種分散固相萃取吸附劑的用量，建立了土壤中多農(nóng)殘前處理方法，采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜對土壤中的多農(nóng)藥殘留進行高效、準(zhǔn)確地測定。

2?實驗部分

2.1?儀器與試劑

LC-30A超高效液相色譜儀（UPLC，日本Shimadzu公司）; AB-SCIEX 4500三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國AB公司）; 臺式離心機（美國Thermo公司）; Filter Unit濾膜（0.22 μm，Agela Technologies公司）。

Fe3O4-PSA參照文獻[14]的方法制備。NaCl、無水MgSO4（分析純）; 甲醇、乙腈（色譜純，美國Merck 公司）; 甲酸銨（HPLC級，美國Tedia公司）; N-丙基乙二胺（PSA）和C18（Agela Technologies公司）; 實驗用水為超純水。

43種農(nóng)藥及6種相關(guān)農(nóng)藥代謝物分析標(biāo)準(zhǔn)品購于上海農(nóng)藥研究所或農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護科研監(jiān)測所，詳見電子版文后支持信息表S1。單標(biāo)儲備液的制備：各標(biāo)準(zhǔn)品分別溶解于甲醇中，各配制成一定濃度的單標(biāo)儲備液; 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：分別準(zhǔn)確移取適量的單標(biāo)儲備液混勻，以甲醇稀釋定容; 基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液根據(jù)需要，現(xiàn)用現(xiàn)配，用空白樣品提取液稀釋成2、5、10、25、50、100和250 μg/L系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

土壤樣品分別采自浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院楊渡基地（嘉興）、浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物與核技術(shù)利用研究所（杭州）和長春。樣品經(jīng)干燥、篩分后使用。其中，在方法優(yōu)化中采用的是浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院楊渡基地土樣。

2.2?實驗方法

稱取土壤樣品（5.00 ±0.05） g于50 mL離心管中，加入10 mL水，混勻，再加入10 mL乙腈，超聲提取10 min。加入1.5 g NaCl和4.0 g無水MgSO4，渦旋1 min， 7000 r/min離心3 min，取上清液凈化。

準(zhǔn)確移取1.0 mL上清液加入到裝有40 mg Fe3O4-PSA、30 mg C18和150 mg無水MgSO4的2 mL離心管中，渦旋1 min，置于磁力架上2～3 s進行分離。移取0.5 mL上清液至裝有0.5 mL水的2 mL離心管中，混勻，過0.22 μm濾膜，待UPLC-MS/MS分析。

2.3?UPLC-MS/MS分析條件

色譜條件： Waters BEH C18色譜柱（100 mm ×2.1 mm， 1.7 μm）; 流動相為5 mmol/L甲酸銨溶液和5 mmol/L甲酸銨-甲醇溶液（1∶9， V/V），流速為0.25 mL/min，柱溫30℃，進樣量5 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧正負(fù)離子源切換模式，正源噴霧電壓5500 V，負(fù)源4500 V，多重反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM），加熱溫度450℃。各化合物的母離子-子離子對及碰撞能量和去簇電壓等參數(shù)見表1。

3?結(jié)果與討論

3.1?樣品前處理方法優(yōu)化

本研究采用超聲萃取結(jié)合磁分散固相萃取技術(shù)對土壤中多農(nóng)藥殘留進行萃取和凈化。在磁分散固相萃取中，磁性材料作為分離介質(zhì)，是關(guān)鍵因素。磁分離過程中，磁性材料在外磁場作用下，可在幾秒內(nèi)實現(xiàn)相分離，樣品前處理便捷、高效。本研究采用Fe3O4-PSA為磁分離載體和凈化材料，磁性材料表面包裹的PSA層可在保持較高磁力的前提下，屏蔽納米粒子間的磁偶極粒子相互作用，防止聚集，有效提高了穩(wěn)定性和分散性。同時，PSA是弱陰離子交換吸附劑，可與基質(zhì)中有機酸、糖類等分子中的羥基形成非共價鍵，去除土壤中此類雜質(zhì) [15]。此外，C18作為一種反相吸附劑，可有效去除土壤基質(zhì)中的脂類和甾醇等非極性物質(zhì)[16]。因此，本研究通過優(yōu)化超聲萃取時間、分散固相萃取劑Fe3O4-PSA和C18的用量，得到更佳的凈化效果與穩(wěn)定的目標(biāo)農(nóng)藥回收率。優(yōu)化過程中以回收率（添加濃度均為100 μg/kg）作為主要評價指標(biāo)。

3.1.1?超聲萃取時間的選擇?超聲萃取時間對農(nóng)藥回收率的影響。當(dāng)超聲時間為10 min時，除倍硫磷（76.6%）外，各樣品回收率在84.8%～118.0%之間; 樣品經(jīng)超聲處理15和20 min時，回收率下降明顯，除倍硫磷（138.0%）外，10.2%～26.5%的農(nóng)藥回收率低于79.8%。因此，選擇樣品超聲時間為10 min。

3.1.2?Fe3O4-PSA用量的選擇?準(zhǔn)確移取1 mL萃取上清液加入到預(yù)裝0.15 g無水MgSO4和不同量Fe3O4-PSA（0、10、20、30、40和50 mg）的2 mL離心管中，經(jīng)凈化、磁分離后，采用UPLC-MS/MS分析。

以RSD評價Fe3O4-PSA的用量對各靶標(biāo)化合物的回收率影響程度，并選擇RSDs高于15%的9種農(nóng)藥進行分析。在不同F(xiàn)e3O4-PSA用量下，除個別條件外，如甲拌磷50.6%（Fe3O4-PSA 50 mg）、甲拌磷砜130%（Fe3O4-PSA 20 mg）、喹硫磷134%（Fe3O4-PSA 30 mg），其余各目標(biāo)化合物的回收率在65.7%～128.0%之間。當(dāng)Fe3O4-PSA用量為40 mg時，9種化合物的回收率在73.4%～108.0%范圍內(nèi)。同時分析Fe3O4-PSA不同用量條件下目標(biāo)分析物的回收率分布范圍，可見Fe3O4-PSA的用量對大部分目標(biāo)農(nóng)藥萃取效果影響明顯，當(dāng)Fe3O4-PSA用量為40 mg時， 49種農(nóng)藥回收率均在73.4%～113.0%范圍內(nèi)。但當(dāng)用量增至50 mg，4種農(nóng)藥回收率低于68.8%，可能是Fe3O4-PSA與部分農(nóng)藥中的OH等通過氫鍵吸附 [14]，綜合考慮，選擇Fe3O4-PSA用量為40 mg。

3.1.3?C18用量的選擇?C18作為常用凈化材料，在有效去除基質(zhì)中非極性雜質(zhì)的同時，也會吸附非極性農(nóng)藥，造成目標(biāo)農(nóng)藥回收率偏低 [17]。固定Fe3O4-PSA用量為40 mg，考察不同C18用量（10、20、30和40 mg）對目標(biāo)分析物回收率的影響，RSD>15%的5種目標(biāo)農(nóng)藥的實驗結(jié)果見電子版文后支持信息圖S2中，C18用量為10、20和40 mg時，各分析物回收率較高，當(dāng)C18的含量為30 mg時，5種目標(biāo)分析物的回收率在83.4%～111.0%之間。不同C18用量下目標(biāo)分析物回收率分布范圍也呈現(xiàn)同樣的結(jié)果，C18加入量為10 mg時，目標(biāo)農(nóng)藥回收率分布分散，14.3%的分析物回收率分布在72.6%～79.1%之間，6.1%的分析物回收率大于126%，隨著C18添加量增加，分析物回收率趨于穩(wěn)定。C18加入量為20、30和40 mg時，土壤中各目標(biāo)分析物回收率分別在74.5%～127.0%，80.5%～111.0%和79.9%～137.0%范圍內(nèi)。因此，選擇C18的用量為 30 mg。

綜上，選擇樣品超聲時間為10 min，分散固相萃取吸附劑用量的組合為40 mg Fe3O4-PSA和30 mg C18。

3.2?方法的線性范圍和靈敏度

配制系列濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)UPLC-MS/MS分析，以農(nóng)藥濃度（x）為橫坐標(biāo)，色譜峰面積（y）為縱坐標(biāo)，進行線性擬合。除3-羥基克百威和水胺硫磷（5～250 μg/L）外，各農(nóng)藥在2～250 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（R）在0.9700～0.9998之間（表2）。以3倍信噪比計算，各農(nóng)藥檢出限（LOD）為0.1～1.0 μg/L。根據(jù)歐盟規(guī)定[18]，定量限（LOQ）為回收率滿足實驗工作要求下的最低添加濃度，本實驗除3-羥基克百威和水胺硫磷的最低添加濃度為20 μg/kg外， 其它目標(biāo)農(nóng)藥在最低添加濃度水平為10 μg/kg時，回收率均在74.1%～120.0%之間，故本方法中3-羥基克百威和水胺硫磷的LOQ為25 μg/kg，其余41種農(nóng)藥及6種相關(guān)代謝物的LOQ為10 μg/kg。

3.3?基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)的評價以基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線與溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率比表示[19]。當(dāng)斜率比<1時，為基質(zhì)抑制效應(yīng); 斜率比=1時，無基質(zhì)效應(yīng); 若斜率比>1，呈基質(zhì)增強效應(yīng)。由表2可知，嘧菌酯（2.55）、 馬拉硫磷（1.55），3-羥基克百威（1.70）呈現(xiàn)基質(zhì)增強效應(yīng); 氯吡脲（0.18）、吡蟲啉（0.23）、克百威（0.26）等8種農(nóng)藥存在明顯的基質(zhì)抑制效應(yīng)，目標(biāo)分析物中40種農(nóng)藥的斜率比在0.72～1.30范圍內(nèi)，說明基質(zhì)效應(yīng)對這些化合物的定量分析影響相對較低。為提高目標(biāo)化合物定量分析的準(zhǔn)確度，均采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線進行定量分析。

3.4?添加回收率和精密度

使用空白土壤樣品進行添加回收實驗，添加水平為10、100和200 μg/kg，其中3-羥基克百威和水胺硫磷由于靈敏度限制，添加濃度為25、100和200 μg/kg， 結(jié)果見電子版文后信息表S1，各目標(biāo)物回收率在71.0%～120.0%之間，RSD為0.5%～18.1% （n=5），本方法的添加回收率與精密度均滿足殘留分析要求。有機磷和氨基甲酸酯農(nóng)藥中各兩種代表性農(nóng)藥提取離子流色譜圖。混配不同濃度農(nóng)藥（分別為10、100與200 μg/kg）的提取離子流色譜圖中各化合物的峰形清晰可辨，即使是LOQ級（10 μg/kg）對應(yīng)的添加回收樣品的峰形也無雜質(zhì)干擾，說明方法的靈敏度可以滿足分析要求。

3.5?實際樣品分析

選取杭州、長春兩地的土壤樣品進行殘留分析（理化性質(zhì)與有機物含量詳見電子版文后支持信息表S2[20]），均未檢測出農(nóng)藥殘留。添加回收實驗（添加水平分別為10、100與200 μg/kg，電子版文后支持信息表S3和表S4）結(jié)果表明，各目標(biāo)分析物在不同理化性質(zhì)土壤的添加回收率在70.0%～128.0%之間，表明此方法可適用于不同性質(zhì)的土壤樣品中的農(nóng)藥殘留分析。

4?結(jié) 論

結(jié)合分散固相萃取技術(shù)綠色、便捷和磁納米材料快速分離的優(yōu)勢，建立了土壤中多農(nóng)藥殘留的分析方法?？疾炝藰悠诽崛『蛢艋^程中各參數(shù)的影響，結(jié)果表明，兩種吸附劑Fe3O4-PSA和C18對目標(biāo)農(nóng)藥影響不同，超聲萃取時間對目標(biāo)化合物的回收率有顯著影響。實驗結(jié)果表明，各目標(biāo)分析物在各自線性范圍內(nèi)的線性良好，靈敏度高，3個添加濃度水平下的回收率及精密度均滿足農(nóng)藥殘留的測定要求。同時，不同理化性質(zhì)土壤基質(zhì)中的添加回收率及精密度也滿足測定要求。本方法前處理快速，與傳統(tǒng)的QuEChERS法相比更方便、省時，分析通量也更高，適用于土壤中多農(nóng)藥殘留分析。

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