蘇遠(yuǎn)婷 項(xiàng)倩彤 崔 偉 張 慧 張汝芝

(1 安徽省合肥市第二人民醫(yī)院皮膚科，合肥市 233000，電子郵箱：suyuanting12345@163.com；2 蘇州大學(xué)第三附屬醫(yī)院皮膚性病科，江蘇省常州市 213003)

DNA甲基化是一種穩(wěn)定的表觀遺傳修飾[1]，在基因表達(dá)調(diào)控、細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、細(xì)胞發(fā)育、基因組印記和DNA突變等方面都起著重要的作用。甲基化程度可調(diào)控組織專一性基因的表達(dá)，基因的轉(zhuǎn)錄水平與其甲基化程度呈負(fù)相關(guān)。因此，多能性相關(guān)基因啟動子的DNA甲基化程度降低是細(xì)胞重編程達(dá)到多能狀態(tài)所必需的[2]。Oct4和Nanog是維持干細(xì)胞多能性和自我更新的轉(zhuǎn)錄因子，可通過結(jié)合靶基因調(diào)控區(qū)選擇性地抑制分化基因表達(dá)或促進(jìn)多能性基因表達(dá)[3]。在分化的細(xì)胞中，Oct-4、Nanog基因啟動子區(qū)域高度甲基化且處于失活狀態(tài)，而在胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell，ESC)中這些啟動子區(qū)域處于去甲基化活化狀態(tài)。有學(xué)者在誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)的重編程過程中檢測到這些區(qū)域完全去甲基化[4]。本研究采用重亞硫酸氫鹽測序PCR，對比分析表皮細(xì)胞和其誘導(dǎo)產(chǎn)生的iPSCs在Oct4和Nanog基因啟動子區(qū)域的甲基化程度。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本來源：包皮和毛囊標(biāo)本來源于蘇州大學(xué)第三附屬醫(yī)院泌尿外科的包皮環(huán)切術(shù)和皮膚科小手術(shù)切除組織。

1.1.2 主要試劑及儀器：人黑素細(xì)胞培養(yǎng)基(M254)、人黑素細(xì)胞生長添加成分(human melanocyte growth supplement，HMGS)、人表皮細(xì)胞培養(yǎng)基、人角質(zhì)形成細(xì)胞生長添加成分(human keratinocyte growth supplement，HKGS)、杜氏改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle medium，DMEM)、0.25%/0.05%胰酶、胎牛血清、干細(xì)胞完全培養(yǎng)基和條件培養(yǎng)基均購自美國Gibaco公司，DNA提取試劑盒購自德國Qiagen公司(批號：51306)，293T飼養(yǎng)層細(xì)胞、慢病毒載體[Lenti-Oct4-GFP(批號：Ab27449)、Lenti-Sox2-GFP(批號：Ab27655)、Lenti-Klf4-GFP和Lenti-c-myc-GFP]購自上海斯丹賽公司，pUC18-T載體、TaqDNA聚合酶、PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒(批號：SK8141)、質(zhì)粒抽提試劑盒(批號：SK8161)、感受態(tài)細(xì)胞制備試劑盒(批號：SK9307)購自生工生物工程(上海)股份有限公司。PCR反應(yīng)擴(kuò)增儀購自加拿大BBI公司，3730型測序列分析儀購自美國ABI。

1.2 方法

1.2.1 獲取細(xì)胞：(1)表皮黑色素細(xì)胞(epidermal melanocytes,EMC)：0.25%中性酶消化包皮組織2 h以分離表皮及真皮，再用0.25%胰酶消化表皮10 min，吹打、中和，獲取細(xì)胞懸液，種植于培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞生長密度達(dá)80%～90%時，進(jìn)行差別胰酶純化，得到純化的EMC，用M254培養(yǎng)基(含HMGS)培養(yǎng)、傳代、擴(kuò)增；(2)表皮角質(zhì)形成細(xì)胞(epidermis keratinocytes,EKC)：獲取方法同EMC，獲取純化的EKC后用含HKGS的人表皮細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)、傳代、擴(kuò)增；(3)耐受胰酶消化的黑色素細(xì)胞(trypsinization-enduring epidermal melanocytes,TE-EMC)：將EMC細(xì)胞懸液在0.25%胰酶中處理4 h，中和，更換M254培養(yǎng)基培養(yǎng)(含HMGS)、傳代、擴(kuò)增；(4)毛囊角質(zhì)形成細(xì)胞(follicular keratinocytes,FKC)：0.25%膠原酶處理成年患者頭皮的毛囊組織2 h，分離毛囊，0.25%胰酶消化15 min，中和、吹打，獲取細(xì)胞懸液，用人表皮細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)(含HKGS)、傳代、擴(kuò)增； (5)iPSCs：將攜帶有Oct4、Klf-4和C-myc 3因子或Oct4、Klf-4、C-myc和Sox-2 4因子的慢病毒載體，按照感染復(fù)數(shù)值(轉(zhuǎn)染時病毒與細(xì)胞數(shù)量的比值)為15 ∶1、細(xì)胞數(shù)為4×104/ml、聚凝胺濃度為10 μg/ml，維生素C濃度為10 μg/ml加入M254培養(yǎng)基，終體積為2 ml，然后轉(zhuǎn)染第3代的EMC，24 h后去除病毒接種于鋪滿滋養(yǎng)層細(xì)胞(293T細(xì)胞)的鼠尾膠原包被板中，用干細(xì)胞完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，接種第12天更換培養(yǎng)基(1/2完全培養(yǎng)基和1/2條件培養(yǎng)基)，在熒光顯微鏡下觀察，約20 d即可見明顯的3因子轉(zhuǎn)染iPSCs(3F-iPSCs)和4因子轉(zhuǎn)染iPSCs(4F-iPSCs)克隆，挑選克隆，擴(kuò)增培養(yǎng)。

1.2.2 DNA提取和重亞硫酸鹽修飾：用胰酶消化呈對數(shù)期生長的6種細(xì)胞(EMC、EKC、TE-EMC、FKC、3F-iPSCs及4F-iPSCs)，用全基因組DNA提取試劑盒抽提細(xì)胞的DNA，溶于200 μl AE液中，用紫外分光光度計(jì)測量核酸吸光度A260和A280值，純度為1.6～2.1為合格DNA。再用亞硫酸氫鹽處理，使未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不變，亞硫酸鹽修飾主要步驟：(1)堿變性：取2 μg DNA稀釋至50 μl，加入5.5 μl的3M氫氧化鈉(NaOH)，置于42℃水浴30 min；(2)硫化和脫氫：加入30 μl的10 mM對苯二酚和520 μl的3.6 M NaOH至上述溶液，混勻，200 μl液狀石蠟防止氧化，50℃避光水浴16 h；(3)純化和脫硫：用純化試劑盒純化修飾后的DNA，再加入5.5 μl的3 M NaOH，室溫放置15 min；(4)沉淀回收：加8 μl的3 M乙酸鈉、4 μl的10 mg/ml糖原和270 μl冰無水乙醇，置于-20℃，過夜沉淀，室溫下12 000 r/min離心10 min，倒去上清液，加500 μl 70%乙醇，室溫下12 000 r/min，離心5 min，去上清；重復(fù)以上操作1次，洗滌、室溫干燥5 min，加入20～30 μl 雙蒸水，溶解沉淀。

1.2.3 PCR擴(kuò)增：以修飾后的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列[由生工生物工程(上海)股份有限公司提供]見表1。PCR反應(yīng)體系：模板3 μl、上下游引物各1 μl、dNTP 1 μl、Tap緩沖液5 μl、Taq酶0.8 μl、去離子水38.2 μl，共50 μl。采用PCR反應(yīng)擴(kuò)增儀擴(kuò)增、3%糖凝膠電泳分離觀察、凝膠成像系統(tǒng)成像。

表1 Oct4和nanog基因上下游引物序列

1.2.4 克隆測序：從電泳板上切割出含目的DNA片段的凝膠塊，將PCR產(chǎn)物純化、回收，再將產(chǎn)物連接到pUC18-T載體，連接反應(yīng)體系包括1 μl 10×連接緩沖液、1 μl 50%聚乙二醇、50 ng pUC18-T載體、0.2 pmol PCR產(chǎn)物、2.5 U T4DNA連接酶，加入相應(yīng)體積的H2O使反應(yīng)終體積為10 μl，18℃連接過夜。制備感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物，取大腸桿菌DH5α(上海生物工程股份有限公司)涂布在預(yù)先用20 μl的100 mM異丙基硫代半乳糖苷和100 μl的20 mg/ml 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷涂布的氨芐西林平板上，倒置培養(yǎng)過夜。選擇在IPTG/X-gal平板上生長的白色菌落，用牙簽挑至含氨芐西林的液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)過夜。用質(zhì)粒抽提試劑盒提取質(zhì)粒，測序由上海生工生物工程有限公司完成。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 6種細(xì)胞的形態(tài) (1)第3代的EMC呈樹根狀，有2～5個樹突(見圖1a)，但第3代TE-EMC多為2個樹突，部分細(xì)胞聚集、排列規(guī)整(見圖1b)；(2)第3代的EKC和FKC，均呈圓形、多角形，鋪路石樣排列，兩者細(xì)胞形態(tài)差異性較小(見圖1c、1d)；(3)用慢病毒載體將4種因子導(dǎo)入EMC，轉(zhuǎn)染培養(yǎng)第3天黑色素細(xì)胞從短棒狀轉(zhuǎn)變?yōu)轭悎A形，部分細(xì)胞聚集成團(tuán)，第10天滋養(yǎng)層細(xì)胞的培養(yǎng)層出現(xiàn)類似于胚胎樣細(xì)胞克隆增生(見圖1e)，體積較小且邊緣較規(guī)整，隨著培養(yǎng)時間延長，胚胎樣克隆數(shù)量不斷增多、體積逐漸增大，在熒光顯微鏡下，可見較強(qiáng)的熒光(見圖1f)；經(jīng)3種轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)導(dǎo)分化的EMC也獲得類似ESC的克隆(見圖1g)，且可見免疫熒光(見圖1h)。

2.2 6種細(xì)胞的甲基化率比較 在Oct4位點(diǎn)，EMC的甲基化率高于3F-iPSCs和4F-iPSCs(均P<0.05)，其他細(xì)胞與EMC的甲基化率比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)；在Nanog位點(diǎn)，EMC的甲基化率高于 TE-EMC、FKC、3F-iPSCs和4F-iPSCs(P<0.05)，EKC的甲基化率高于FKC(P<0.05)。 見表2及圖2。

表2 6種細(xì)胞的甲基化程度[n(%)]

注：與EMC比較，*P<0.05；與EKC比較，#P<0.05。

3 討 論

目前研究表明DNA甲基化水平和體細(xì)胞基因沉默促成重編程，評估體細(xì)胞基因啟動子DNA甲基化狀態(tài)可驗(yàn)證新iPSCs系[5]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)iPSCs 和ESC 間存在差異性[6]，低代iPSCs保留著起始細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄記憶，持續(xù)性傳代，會縮小差異，提示iPSCs逐漸丟失從母細(xì)胞遺傳的特性，而啟動子DNA不完全甲基化部分解釋了母細(xì)胞基因的持續(xù)性表達(dá)。DNA去甲基化引導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)化沿著正確軌道進(jìn)行[7]：首先，脫甲基化建立DNA甲基化新模型，為胚胎通過卵合子重編程獲得多能性，或通過原生殖細(xì)胞卵合子恢復(fù)全能性鋪路；其次，低甲基化的啟動子是關(guān)鍵性分化因子，在發(fā)育階段，種系特異性基因打開譜系特異性轉(zhuǎn)錄循環(huán)，導(dǎo)致有效地分化。因此，DNA去甲基化充當(dāng)細(xì)胞分化的監(jiān)視角色，是干細(xì)胞發(fā)育過程中的墊腳石[8]。

Oct4是人類基因組6號染色體中POU5F1基因所編碼，屬于POU家族中八聚體結(jié)合亞組的成員，是多潛能細(xì)胞轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的核心部分，通過單獨(dú)識別或與其他轉(zhuǎn)錄因子相互協(xié)作，結(jié)合DNA調(diào)控域起作用，可募集不同功能的因子以建立基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，且決定細(xì)胞的早期命運(yùn)，在原胚形成階段促進(jìn)細(xì)胞系的形成[9]。Nanog是Chambers等[10]在囊胚內(nèi)細(xì)胞群、原始生殖細(xì)胞以及胚胎干細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄因子，是維持ESC自我更新和多潛能性的重要調(diào)控因子，在胚胎發(fā)育過程中能調(diào)控多能性內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的命運(yùn)，在維持外胚層多能性和阻止向原始內(nèi)胚層分化中起著關(guān)鍵性的作用。

Yamanaka和Takahashi首次用4種轉(zhuǎn)錄因子(Klf4、Sox2、Oct4和C-myc)將鼠成纖維細(xì)胞重編程為iPSCs[11]。重編程的效率或與細(xì)胞代數(shù)、類型和起源有關(guān)，而相對于成纖維細(xì)胞，黑色素細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞較易誘導(dǎo)為iPSCs，這是因?yàn)樗鼈兣cESC一樣都起源于外胚層，而成纖維細(xì)胞源于中胚層[12]。Wakao等[13]曾用胰酶處理表皮成纖維細(xì)胞，獲取一種能夠發(fā)育成人體各種組織和臟器的新型干細(xì)胞，即多系分化持續(xù)應(yīng)激細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)得到的TE-EMC多以雙極為主，部分樹突較短，呈棒槌樣，有些聚集成“魚群”狀，從形態(tài)學(xué)推測，比胰酶消化得到的黑色素細(xì)胞更接近原始態(tài)。此外，這兩種細(xì)胞在Nanog基因啟動子的甲基化程度有差異性，其中TE-EMC未甲基化位點(diǎn)多于EMC(P<0.05)，表明其甲基化程度低，具有較強(qiáng)的干性，且其獲取方法比差別胰酶消化法獲得EMC的方法簡單，可作為一種新型的實(shí)驗(yàn)方法。但TE-EMC是否與多系分化持續(xù)應(yīng)激細(xì)胞有相似的作用，還需進(jìn)一步研究。EKC和FKC的形態(tài)相似，但FKC在Nanog啟動子區(qū)域未甲基化位點(diǎn)多于EKC(P<0.05)，表示其分化程度較低。

我們用攜帶4因子(Oct4、Klf-4、C-myc、Sox-2)的慢病毒轉(zhuǎn)染EMC重編程為iPSCs，另外利用黑色素細(xì)胞自分泌Sox-2的優(yōu)勢[14]，我們將3因子(Oct4、Klf-4、C-myc)導(dǎo)入黑色素細(xì)胞，同樣在培養(yǎng)10d左右，顯微鏡下可觀察到立體生長的克隆。兩種iPSCs的形態(tài)與ESC一樣，且兩者在啟動子Oct4和Nanog基因的甲基化程度相似，說明干性程度相似，但與起始EMC比較，甲基化程度降低(P<0.05)，表明重編程的iPSCs在Oct4和Nanog基因位點(diǎn)上處于低甲基化狀態(tài)。此外，在表皮黑色素細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)的iPSCs中Sox-2是可忽略的[15]，因此本實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步表明了表達(dá)其中一個內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄因子的黑色素細(xì)胞，比角質(zhì)形成細(xì)胞和成纖維細(xì)胞更適合誘導(dǎo)重編程，且黑色素細(xì)胞在臨床也更易獲取。

目前，對于iPSCs表觀遺傳的理解主要來自分析個別位點(diǎn)的途徑，集中單個基因或單個表觀遺傳標(biāo)記物。將來或許可以通過監(jiān)測全基因組的方法，發(fā)現(xiàn)新的表觀遺傳修飾原理，進(jìn)一步的理解其調(diào)節(jié)機(jī)制，從而利于我們操縱細(xì)胞命運(yùn)的轉(zhuǎn)變，例如分化、重編程和分化轉(zhuǎn)換，即基本的表觀遺傳過程。現(xiàn)在已經(jīng)存在一系列表觀遺傳抑制劑，能提升iPSCs的產(chǎn)量。隨著表觀遺傳機(jī)制新觀點(diǎn)的提出[16]，我們能夠設(shè)計(jì)出更多的方法，誘導(dǎo)細(xì)胞向我們所需的方向轉(zhuǎn)變。而這些新觀點(diǎn)為在細(xì)胞命運(yùn)轉(zhuǎn)化過程中研究動態(tài)的表觀遺傳提供更好的工具。

綜上所述，細(xì)胞甲基化程度可能與其來源、形態(tài)、分化程度有關(guān)，與起始EMC比較，Nanog位點(diǎn)上TE-EMC、FKC、3F-iPSCs和4F-iPSCs的甲基化程度降低，兩種iPSCs的甲基化程度相似。細(xì)胞甲基化程度可能與其來源、形態(tài)和分化程度有關(guān)。