陳 翔 黃 瑩 龍春藝 廖品琥

(右江民族醫(yī)學(xué)院研究生院，廣西百色市 533000，電子郵箱：chenxiang8667@163.com)

膿毒癥是感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征，其發(fā)病率及病死率均高，已成為ICU的首要問題[1]。膿毒癥的主要病理機(jī)制為：促炎反應(yīng)與抗炎反應(yīng)的失衡，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的重塑，并進(jìn)一步造成細(xì)胞損傷[2]。但其具體機(jī)制尚未完全闡明。金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)是一類可以降解ECM的蛋白酶家族，其中MMP-2可以通過分解ECM的主要成分Ⅳ型膠原和明膠，參與ECM重塑[3]。在血清中MMP-2水平與膿毒癥預(yù)后之間存在相關(guān)性[4]。

微小核糖核酸(micro ribonucleic acid，miR)直接或間接參與膿毒癥的發(fā)生發(fā)展，可以作為膿毒癥診斷標(biāo)志物和治療靶標(biāo)[5]。其中miR-29a可以通過廣泛抑制纖維蛋白酶原和調(diào)控ECM相關(guān)基因表達(dá)，參與肝硬化等疾病進(jìn)程，而纖維蛋白酶原與細(xì)胞和ECM發(fā)生黏附密切相關(guān)[6]，提示miR-29a可能參與調(diào)控細(xì)胞增殖和黏附。然而miR-29a在膿毒癥中的作用和潛在機(jī)制尚不清楚。

迄今為止，尚無文獻(xiàn)明確報(bào)告關(guān)于miR-29a和MMP-2在膿毒癥患者血清和細(xì)胞模型中表達(dá)水平及相關(guān)性。本研究通過探討miR-29a和MMP-2在膿毒癥發(fā)生發(fā)展中的作用，探索miR-29a的可能調(diào)控機(jī)制，為臨床診斷和治療膿毒癥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 血清標(biāo)本來源 選擇2017年9月至2018年3月在右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院ICU治療的40例膿毒癥患者(膿毒癥組)，均符合膿毒癥3.0診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]，其中男性23例，女17例，年齡(45.97±16.40)歲。另選同期在該院體檢的40例健康者作為對(duì)照組，其中男性21例，女性19例，年齡(44.93±17.30)歲。兩組的年齡、性別比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意，患者及家屬對(duì)研究知情并簽署同意書。

1.2 儀器與試劑 DU530型超微量紫外分光光度計(jì)購自德國Beckman公司，ABI 7500型實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)儀購自美國 Bio-Rad 公司，Multiskan MK3型酶標(biāo)儀購自美國Thermo Fisher Scientific公司，伯樂1658001型Western 電泳儀及轉(zhuǎn)膜儀購自美國 Bio-Rad公司，JS-680B型全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)購自上海培清科技有限公司。MMP-2酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒購自美國R&D公司(批號(hào)：000257)，杜氏改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle medium，DMEM)購自美國Gibco公司(批號(hào)：10099-141)，細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑購自美國Thermo Fisher Scientific公司(批號(hào)：U87654)，PCR引物、血清miR提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量試劑盒均購自北京天根科技公司(批號(hào)：DP503、KR201、FP411)，miR-29a抑制劑、模擬物和對(duì)照物購自上海吉碼公司(批號(hào)：1307028、1307046、1307021)，脂質(zhì)體2000購自美國Thermo Fisher Scientific公司(批號(hào)：11668-027)，細(xì)胞裂解液購自索萊寶生物公司(批號(hào)：PC0019)，MMP-2一抗購自美國Abcam公司(批號(hào)：AB86607)。RAW 264.7細(xì)胞購自上海中國科學(xué)院細(xì)胞庫。脂多糖購自美國Sigma公司(批號(hào)：1010A032)。

1.3 血清MMP-2蛋白及血清miR-29a表達(dá)水平的檢測(cè) 使用乙二胺四乙酸抗凝管采集膿毒癥組(于治療前檢測(cè))及對(duì)照組研究對(duì)象的靜脈血5 ml，置于離心機(jī)4℃、3 000 r/min離心15 min，取上層血清置于1.5 ml EP管，4℃、12 000 r/min離心30 min后，將上層血清轉(zhuǎn)移至另一1.5 ml EP管中，置于-80℃冰箱保存。按照ELISA試劑盒說明書檢測(cè)血清MMP-2表達(dá)水平。取200 μl血清，用離心柱法提取總RNA，按照試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR。以U6為內(nèi)參， 采用2-△△Ct法進(jìn)行分析。

1.4 MMP-2的生物信息學(xué)分析 應(yīng)用靶基因預(yù)測(cè)軟件 TargetScan7.1(http://www.targetscan.org/)及miRanda(http://www.miranda.org/)對(duì)MMP-2靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，取任兩者預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)交集再結(jié)合miTarbase(http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/)中已經(jīng)證實(shí)的靶基因用于后續(xù)分析。

1.5 過表達(dá)miR-29a的RAW 264.7細(xì)胞增殖情況 取對(duì)數(shù)生長期的RAW 264.7細(xì)胞，以4×103個(gè)/200 μl接種于96孔板中，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)12 h。將細(xì)胞分為miR-29a對(duì)照物組和miR-29a模擬物組，在培養(yǎng)孔中分別加入miR-29a對(duì)照物/脂質(zhì)體2000混合液、miR-29a模擬物/脂質(zhì)體2000混合液，轉(zhuǎn)染6 h后棄去培養(yǎng)液。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，分別于干預(yù)21 h、45 h、69 h、93 h時(shí)加入10 mg/ml的CCK-8 試劑10 μl，3 h后即干預(yù)結(jié)束時(shí)(共干預(yù)24 h、48 h、72 h、96 h)棄液，每孔加入100 μl二甲基亞砜，靜置孵育30 min，于490 nm波長下測(cè)定每孔的吸光度(A)值。

1.6 不同濃度脂多糖刺激下RAW 264.7細(xì)胞MMP-2表達(dá)情況 取濃度為0 μg/ml、 1 μg/ml、5 μg/ml、10 μg/ml脂多糖分別刺激RAW 264.7細(xì)胞24 h，免疫印跡試驗(yàn)法測(cè)定MMP-2蛋白的表達(dá)水平。根據(jù)所得結(jié)果，篩選膿毒癥細(xì)胞模型的最適宜脂多糖濃度，并進(jìn)行后續(xù)的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。

1.7 過表達(dá)miR-29a的膿毒癥細(xì)胞模型MMP-2表達(dá)情況 RAW 264.7細(xì)胞置于含10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h。將RAW 264.7細(xì)胞接種于六孔板(1.0×105個(gè)/孔)中過夜。將細(xì)胞分為脂多糖組、脂多糖+miR-29a抑制物組、脂多糖+miR-29a模擬物組和脂多糖+miR-29a對(duì)照物組，在含有細(xì)胞的1 500 μl培養(yǎng)基的培養(yǎng)孔中分別加入磷酸緩沖鹽溶液、miR-29a抑制物/脂質(zhì)體2000混合液、miR-29a模擬物/脂質(zhì)體2000混合液、miR-29a對(duì)照物/脂質(zhì)體2000的混合液；培養(yǎng)6 h后，將含混合液的培養(yǎng)基移去，更換新鮮培養(yǎng)基，加入10 μg/ml脂多糖，將培養(yǎng)板置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后免疫印跡試驗(yàn)法測(cè)定MMP-2蛋白的表達(dá)。

1.8 免疫印跡試驗(yàn)法測(cè)定MMP-2蛋白的表達(dá) 取不同濃度脂多糖刺激后24 h和轉(zhuǎn)染后24 h的各組細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液后提取蛋白，并用二喹啉甲酸法檢測(cè)蛋白濃度，取60 μg蛋白樣品進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)膜至聚偏二氟乙烯膜，室溫封閉1 h，加入MMP-2一抗4℃孵育過夜，TBST清洗3次，10 min/次。加入二抗室溫孵育1 h，TBST清洗3次，10 min/次。洗膜結(jié)束后用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行顯影。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)為內(nèi)參。一抗MMP-2、GAPDH、二抗稀釋比例分別為1 ∶1 000、1 ∶5 000、1 ∶5 000。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，重復(fù)測(cè)量計(jì)量資料比較采用重復(fù)測(cè)量方差分析；采用Pearson相關(guān)分析進(jìn)行相關(guān)性分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組MMP-2及miR-29a的表達(dá)水平 膿毒癥組血清MMP-2表達(dá)水平高于對(duì)照組，而miR-29a的相對(duì)表達(dá)水平低于對(duì)照組(均P<0.05)，見表1 。膿毒癥組患者血清miR-29a與MMP-2的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.332，P<0.001) 。

表1 兩組MMP-2和miR-29a表達(dá)水平比較(x±s)

2.2 生物信息學(xué)分析結(jié)果 MMP-2與miR-29a序列高度互補(bǔ)，MMP-2可能為miR-29a的靶基因，見表2。

表2 生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)結(jié)果

2.3 miR-29a對(duì)照物組與miR-29a模擬物組RAW 264.7細(xì)胞增殖比較 兩組增殖水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F組間=66.799，P組間=0.001)，其中72 h時(shí)miR-29a模擬物組的增殖水平低于miR-29a對(duì)照物組(P<0.05)；兩組增殖水平均隨時(shí)間延長而升高(F時(shí)間=355.962，P時(shí)間<0.001)；分組與時(shí)間有交互效應(yīng)(F交互=12.467，P交互<0.001)。見表3。

表3 miR-29a對(duì)照物組與miR-29a模擬物組不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增殖水平比較(x±s)

注：與miR-29a對(duì)照物組比較，*P<0.05。

2.4 不同濃度脂多糖刺激下RAW 264.7細(xì)胞MMP-2表達(dá)情況 0 μg/ml脂多糖、 1 μg/ml脂多糖、5 μg/ml脂多糖、10 μg/ml脂多糖刺激下RAW 264.7細(xì)胞MMP-2蛋白相對(duì)表達(dá)水平依次升高(均P<0.05)，見表4。因此，將10 μg/ml作為建立膿毒癥細(xì)胞模型的最適宜脂多糖濃度，并進(jìn)行后續(xù)的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。

表4 不同濃度脂多糖刺激24 h后MMP-2相對(duì)表達(dá)量比較(x±s)

注：與0 μg/ml脂多糖比較，*P<0.05；與1 μg/ml脂多糖比較，#P<0.05；與5 μg/ml脂多糖比較，▲P<0.05。

2.5 不同miR-29a表達(dá)水平的膿毒癥細(xì)胞模型MMP-2表達(dá)情況比較 與脂多糖組及脂多糖+miR-29a對(duì)照物組比較，脂多糖+miR-29a抑制物組MMP-2蛋白相對(duì)表達(dá)水平升高，而脂多糖+miR-29a模擬物組的MMP-2蛋白相對(duì)表達(dá)水平降低(均P<0.05)，脂多糖+miR-29a抑制物組MMP-2蛋白相對(duì)表達(dá)水平高于脂多糖+miR-29a模擬物組(P<0.05)。見表5。

表5 4組細(xì)胞MMP-2蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較(x±s)

注：與脂多糖組比較，*P<0.05；脂多糖+miR-29a對(duì)照物組比較，▲P<0.05；與脂多糖+miR-29a抑制物組比較，#P<0.05。

3 討 論

MMP-2可以通過直接降解或間接影響細(xì)胞因子參與ECM的生理和病理重塑。MMP-2在正常細(xì)胞中的表達(dá)量極低，與金屬蛋白酶組織抑制劑處于動(dòng)態(tài)平衡，維持ECM的正常形態(tài)和功能。而在膿毒癥患者中MMP-2表達(dá)的改變?cè)斐蒑MP與金屬蛋白酶組織抑制劑間失衡，同時(shí)激活的MMP-2還可通過切除MMP酶原的前肽使其激活產(chǎn)生正反饋放大效應(yīng)，最終導(dǎo)致ECM降解，造成細(xì)胞損傷[7]。既往研究表明，膿毒癥大鼠心臟組織中MMP-2的表達(dá)水平改變可能導(dǎo)致心肌抑制和ECM重塑[8]，但其具體作用仍存在爭議。

本研究結(jié)果顯示，膿毒癥患者血清MMP-2表達(dá)水平和膿毒癥細(xì)胞模型(10 μg/ml脂多糖)中MMP-2表達(dá)水平升高(P<0.05)。其他學(xué)者也發(fā)現(xiàn)，存活組膿毒癥患者M(jìn)MP-2水平低于非存活組患者，認(rèn)為MMP-2可能參與膿毒癥的進(jìn)程，可作為膿毒癥診斷和治療標(biāo)志物[8]。但MMP-2在膿毒癥進(jìn)展過程中的變化情況及臨床作用仍存在爭議。研究顯示，與健康對(duì)照組相比，嚴(yán)重膿毒癥患者M(jìn)MP-2水平上升但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且與臨床預(yù)后無關(guān)[9]。導(dǎo)致本研究結(jié)果與該研究結(jié)果相悖的原因可能有：(1)選取研究對(duì)象不同：該研究選取嚴(yán)重膿毒癥患者且患者在不同的疾病階段入組，并受到藥物治療等影響，異質(zhì)性較高，而本研究樣本選取的是膿毒癥初次確診24 h后的血液標(biāo)本，異質(zhì)性較低。(2)MMP-2檢測(cè)方式差異：該研究觀察到的是血清有活性的MMP-2蛋白表達(dá)升高，而本研究檢測(cè)的是MMP-2蛋白總量，未單獨(dú)檢測(cè)有活性的MMP-2；然而活性MMP-2蛋白表達(dá)升高可能是MMP-2總蛋白升高的局部變現(xiàn)之一，并不能完全代表MMP-2的總體水平。有關(guān)MMP-2在膿毒癥中的作用研究較少，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

MiR-29a可以通過廣泛抑制纖維蛋白酶原和調(diào)控ECM相關(guān)基因表達(dá)，參與肝硬化等疾病的進(jìn)程[10-11]。既往研究表明miR-29a可能為膿毒癥患者死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[12]，然而miR-29a在膿毒癥中的作用尚未闡明。為了進(jìn)一步研究miR-29a在膿毒癥中的作用，本研究應(yīng)用PCR檢測(cè)膿毒癥患者血清miR-29a表達(dá)情況，結(jié)果顯示膿毒癥組血清miR-29a相對(duì)表達(dá)水平下降(P<0.05)，提示miR-29a可能參與膿毒癥的發(fā)生，但具體機(jī)制不明。本研究通過轉(zhuǎn)染miR-29a構(gòu)建了miR-29a過表達(dá)細(xì)胞模型，結(jié)果顯示72 h時(shí)miR-29a模擬物組的增殖水平低于miR-29a對(duì)照物組(P<0.05)，提示過表達(dá)miR-29a可以抑制細(xì)胞增殖。這意味著miR-29a可能通過調(diào)控細(xì)胞周期參與膿毒癥進(jìn)程。

在血管平滑肌細(xì)胞中，miR-29模擬物可以通過直接靶向于MMP-2調(diào)控細(xì)胞凋亡[13]。此外，鈣化的動(dòng)脈組織中miR-29a對(duì)MMP-2有直接調(diào)控作用[14]，而在結(jié)直腸癌患者血清中，miR-29與MMP-2相互聯(lián)系，共同參與疾病進(jìn)展[15]。這些研究結(jié)果提示miR-29a可以在不同水平層次上參與調(diào)控MMP-2及疾病進(jìn)程。但目前miR-29a表達(dá)水平及其對(duì)MMP-2與膿毒癥的影響仍需進(jìn)一步研究。本研究的相關(guān)性分析結(jié)果顯示，膿毒癥患者血清miR-29a與MMP-2表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)；此外，通過生物信息學(xué)分析并應(yīng)用miRanda和TargetScan軟件預(yù)測(cè)調(diào)控MMP-2的miR，發(fā)現(xiàn)MMP-2與miR-29a序列高度互補(bǔ)，MMP-2可能是miR-29a的靶基因。為了進(jìn)一步探索兩者之間的調(diào)控機(jī)制，本研究將miR-29a轉(zhuǎn)染RAW 264.7細(xì)胞后觀察脂多糖刺激下MMP-2蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示與脂多糖組及脂多糖+miR-29a對(duì)照物組比較，脂多糖+miR-29a抑制物組MMP-2蛋白相對(duì)表達(dá)水平升高，而脂多糖+miR-29a模擬物組的MMP-2蛋白相對(duì)表達(dá)水平降低(均P<0.05)，即miR-29a過表達(dá)的膿毒癥模型細(xì)胞MMP-2蛋白的表達(dá)下調(diào)，而抑制miR-29a的表達(dá)后膿毒癥模型細(xì)胞MMP-2蛋白的表達(dá)上調(diào)，這提示miR-29a可能通過調(diào)控MMP-2水平參與膿毒癥進(jìn)程。

綜上所述，MMP-2及miR-29a均與膿毒癥的發(fā)生密切相關(guān)，miR-29a可能通過調(diào)控MMP-2水平參與膿毒癥。miR-29a或可成為膿毒癥治療的新靶點(diǎn)，及早對(duì)膿毒癥患者進(jìn)行以miR為靶點(diǎn)的干預(yù)治療可能取得較好效果。而miR-29a調(diào)控MMP-2水平的具體機(jī)制尚未闡明，其是否通過此途徑調(diào)節(jié)MMP-2表達(dá)參與膿毒癥進(jìn)程仍需進(jìn)一步的研究。