李賀群，徐暉，嚴波，侯瑩，黃大福，張雷

南京市溧水區(qū)人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，南京 2112000

卵巢癌是臨床發(fā)病率較高的婦科惡性腫瘤之一。21世紀以來，女性承擔的社會責任越來越重，工作和生活節(jié)奏日益緊張，卵巢癌的發(fā)病率逐年上升[1]。由于卵巢解剖位置隱匿，早期臨床癥狀不典型，多數(shù)患者確診時已至中晚期，甚至已發(fā)生盆腔和腹腔轉(zhuǎn)移，預后較差，5年生存率僅為30%[2]。目前，國際上普遍認可的晚期卵巢癌標準的治療方案為腫瘤細胞減滅術聯(lián)合術后化療[3]。但由于部分患者確診時已發(fā)生盆腔和腹腔廣泛的種植轉(zhuǎn)移，難以實現(xiàn)滿意減瘤，因此，越來越多的學者建議，卵巢癌可先進行新輔助化療[4]，降低腫瘤負荷從而為患者創(chuàng)造能夠達到滿意減瘤的手術條件。近年來，隨著新輔助化療方法的不斷進展，越來越多的晚期卵巢癌患者可實現(xiàn)滿意減瘤，但仍有部分患者對新輔助化療的敏感性不高，因此，如何預測這類患者的復發(fā)轉(zhuǎn)移風險，成為新輔助化療亟待解決的難題。免疫微環(huán)境一直是腫瘤領域研究的熱點，與多種惡性腫瘤的預后密切相關。研究顯示，卵巢癌組織和癌旁組織中均浸潤著大量的免疫細胞，包括CD8+細胞毒性T細胞（cytoxic T lymphocyte，CTL）和叉頭/翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子（forkhead/wingedhelix transcription factor，F(xiàn)OXP3）調(diào)節(jié)性T細胞（regulatory T cell，Treg）[5]，但目前關于腫瘤局部免疫與新輔助化療預后的相關性研究仍較少。本研究分析晚期卵巢癌患者腫瘤浸潤免疫細胞對新輔助化療敏感性的預測價值，為后續(xù)個體化治療提供參考依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2013年7月至2017年6月在南京市溧水區(qū)人民醫(yī)院接受新輔助化療的晚期卵巢癌患者的臨床資料。納入標準：①經(jīng)病理學活檢和細胞學檢查確診為晚期卵巢癌；②術前接受1～2個療程的以鉑類藥物為基礎的新輔助化療方案治療；③臨床資料完整；④復發(fā)后隨訪時間≥6個月。排除標準：①新輔助化療前接受放療或化療的患者；②新輔助化療前接受激素替代治療或免疫治療的患者；③依從性差的患者。依據(jù)納入和排除標準，共納入82例晚期卵巢癌患者，年齡26～71歲，平均年齡為（51.05±7.17）歲；依據(jù)國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（International Federation of Gynecology and Obstetrics，F(xiàn)IGO）分期標準，所有患者均為Ⅲ～Ⅳ期。

1.2 方法

1.2.1 治療方法 所有患者均接受紫杉醇/多西他賽+卡鉑/順鉑化療方案：第1天，紫杉醇135～175 mg/m2或多西他賽75～100 mg/m2，靜脈滴注；第2 天，卡鉑 300～400 mg/m2或順鉑75～100 mg/m2，靜脈滴注。同時給予對癥處理，每3周為1個療程，共治療1～2個療程，療程結束停藥2周，所有患者接受婦科檢查和影像學檢查，無手術禁忌證的患者可接受腫瘤細胞減滅術。

1.2.2 染色方法 按照病例編號調(diào)取在本院病理科存檔的石蠟包埋的病理組織，脫蠟水化后切片，置于載玻片上，烘干48 h后備用。將組織切片逐步進行二甲苯脫蠟（二甲苯I和二甲苯Ⅱ各5 min）和乙醇梯度水化（100%乙醇和95%乙醇各5 min），加入磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）沖洗5 min，重復3次；然后加入檸檬酸緩沖液進行組織抗原修復，室溫下冷卻30～60 min，PBS沖洗3次。滴加H2O2，室溫下孵育10 min，PBS沖洗3次；滴加一抗（1∶200稀釋），4℃孵育過夜，PBS沖洗3次；滴加二抗，室溫下孵育60 min，PBS沖洗3次；加入二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）試劑顯色；蘇木精復染；脫水后，采用中性樹膠封片。室溫下干燥48 h后，由2名以上經(jīng)驗豐富的病理科醫(yī)師讀片并分析免疫組織化學染色結果，不一致時由第3名醫(yī)師按照評分標準進行評定。

1.3 觀察指標和評價標準

1.3.1 臨床療效 依據(jù)實體瘤療效評價標準（RECIST 1.1）[6]評估臨床療效：完全緩解（complete response，CR），腫瘤病灶完全消失；部分緩解（partial response，PR），靶病灶最大徑之和縮小≥30%；疾病進展（progressive disease，PD），靶病灶最大徑之和增加≥20%或出現(xiàn)新病灶；疾病穩(wěn)定（stable disease，SD），介于PR和PD之間?？陀^緩解率（objective response rate，ORR）=（CR+PR）例 數(shù)/總 例 數(shù) ×100%。病理學完全緩解（pathologic complete response，pCR）：卵巢癌組織和淋巴結內(nèi)未見浸潤性腫瘤細胞殘留[7]。

1.3.2 染色結果判定 CD8+CTL和FOXP3+Treg均定位于細胞核，免疫組織化學染色均呈棕黃色，選擇細胞浸潤的中位數(shù)作為判定截點，高于中位數(shù)即為高表達，低于中位數(shù)即為低表達。由2名經(jīng)驗豐富的病理科專業(yè)醫(yī)師單獨讀片，若判定結果不一致，協(xié)商后確定最終結果。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0軟件對-數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，組內(nèi)比較采用配對樣本t檢驗，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；計數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較用χ2檢驗；晚期卵巢癌患者ORR的影響因素采用Logistic回歸分析；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 CD8+CTL和FOXP3+Treg在卵巢癌組織和癌旁組織中的表達

CD8表達于細胞膜，散在分布于卵巢癌組織內(nèi)，聚集分布于癌旁組織；FOXP3表達于細胞核，在卵巢癌組織和癌旁組織多呈散在分布，少部分呈聚集分布（圖1）。新輔助化療前，癌旁組織中CD8+CTL和FOXP3+Treg表達水平均明顯高于卵巢癌組織（t=12.598，P＜0.01；t=17.537，P＜0.01）。新輔助化療后，癌旁組織中CD8+CTL和FOXP3+Treg的表達水平均明顯高于卵巢癌組織（t=12.172，P＜0.01；t=9.467，P＜0.01）；且FOXP3+Treg在卵巢癌組織和癌旁組織中的表達水平均明顯低于新輔助化療前（t=13.555，P＜0.01；t=18.034，P＜0.01）；但CD8+CTL在卵巢癌組織和癌旁組織中的表達水平與新輔助化療前比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。（表1）

圖1 CD8+CTL和FOXP3+Treg在卵巢癌組織和癌旁組織中的表達情況（×100）

表1 CD8+CTL和FOXP3-+Treg在卵巢癌組織和癌旁組織中的表達水平（%，x±s）

2.2 CD8+CTL和FOXP3+Treg的陽性表達率與晚期卵巢癌患者臨床特征的關系

不同分化程度和FIGO分期的晚期卵巢癌患者的卵巢癌組織和癌旁組織CD8+CTL和FOXP3+Treg陽性表達率比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。（表 2）

表2 不同臨床特征晚期卵巢癌患者CD8+CTL和FOXP3+Treg的陽性表達情況

2.3 晚期卵巢癌患者ORR影響因素的單因素分析

新輔助化療后，61例患者達到客觀緩解，ORR為74.39%。單因素分析結果顯示，不同F(xiàn)IGO分期、卵巢癌組織FOXP3+Treg表達水平、癌旁組織CD8+CTL表達水平的晚期卵巢癌患者的ORR比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。（表3）

表3 82例晚期卵巢癌患者ORR影響因素的單因素分析

2.4 新輔助化療后晚期卵巢癌患者ORR影響因素的多因素分析

將單因素分析中差異有統(tǒng)計學意義的FIGO分期、卵巢癌組織FOXP3+Treg表達水平、癌旁組織CD8+CTL表達水平納入多因素Logistic回歸分析，結果顯示，癌旁組織CD8+CTL高表達、卵巢癌組織FOXP3+Treg低表達、FIGO分期為Ⅳ期是ORR的影響因素。（表 4）

表4 新輔助化療后82例晚期卵巢癌患者ORR影響因素的多因素Logistic回歸分析

2.5 緩解組和未緩解組CD8+CTL和FOXP3+Treg的表達情況

新輔助化療后，15例患者達到pCR，pCR率為18.29%，并依據(jù)是否達到pCR分為緩解組（n=15）和未緩解組（n=67）。未緩解組患者卵巢癌組織和癌旁組織中FOXP3+Treg表達水平均高于緩解組患者（t=2.144，P=0.035；t=8.765，P＜0.01）；但兩組患者CD8+CTL表達水平比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。（表5）

3 討論

腫瘤免疫微環(huán)境一直都是腫瘤研究領域的熱點和難點。腫瘤細胞本身具有免疫原性，可被正常的免疫系統(tǒng)識別并殺滅；但腫瘤細胞又可以分泌炎性因子，降低自身免疫原性，從而逃脫免疫系統(tǒng)的攻擊，這就是所謂的“免疫逃逸”。研究顯示，化療、放療等抗腫瘤治療的敏感性均與腫瘤免疫微環(huán)境密切相關[8]。

表5 緩解組和未緩解組晚期卵巢癌-患者CD8+CTL和FOXP3+Treg的表達情況（%，x±s）

卵巢癌是病死率最高的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一[9]，因卵巢的解剖位置特殊且缺乏典型的早期臨床表現(xiàn)，多數(shù)患者確診時已至中晚期。目前，臨床一般采用減瘤術聯(lián)合術后輔助放化療治療晚期卵巢癌，但多數(shù)患者很難達到滿意減瘤。為提高滿意減瘤率，20世紀70年代，Griffiths提出將新輔助化療作為晚期卵巢癌患者可供選擇的治療方案，即在減瘤術前先進行數(shù)個療程的化療，使病灶松動壞死、腹腔積液量減少后再實施減瘤術。Denkert等[10]學者認為，新輔助化療前腫瘤浸潤淋巴細胞（tumor infiltrating lymphocyte，TIL）數(shù) 與pCR密切相關，TIL數(shù)越多，患者接受新輔助化療后pCR率越高。表明腫瘤局部免疫反應可提高化療的敏感性。CD8+CTL和FOXP3+Treg是兩類最重要的免疫功能相反的淋巴細胞，前者具有細胞毒性可使腫瘤細胞凋亡，而后者可抑制或分泌抑制性細胞因子誘導T細胞耐受，從而導致免疫抑制[11-12]。本研究旨在探討新輔助化療對晚期卵巢癌患者局部免疫微環(huán)境的影響，以及CD8+CTL和FOXP3+Treg對新輔助化療敏感性的影響。

本研究首先探討新輔助化療前后腫瘤局部免疫細胞浸潤的變化情況，結果顯示，F(xiàn)OXP3+Treg在卵巢癌組織和癌旁組織中的表達水平均明顯低于新輔助化療前（P＜0.05）；但CD8+CTL在卵巢癌組織和癌旁組織中的表達水平與新輔助化療前比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。表明卵巢癌組織局部免疫能力增強，且FOXP3+Treg對化療的敏感性更強。但有研究顯示，化療后CD8+和FOXP3+細胞數(shù)均有所降低，且CD8+/FOXP3+比值與化療前相比有所增加[13]。這可能是因為腫瘤免疫微環(huán)境本身極為復雜，不同的化療方案、化療時間和腫瘤類型會導致腫瘤的免疫狀態(tài)不甚相同。此外，Li等[11]研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織中FOXP3+低表達水平的卵巢癌患者的pCR率更高，與本研究結果基本一致。本研究結果顯示，未緩解組患者卵巢癌組織和癌旁組織FOXP3+Treg表達水平均高于緩解組患者，表明癌旁組織FOXP3+Treg表達水平可能與化療達到pCR密切相關。

對新輔助化療敏感性較高的腫瘤患者更容易實現(xiàn)滿意減瘤，因此，評估新輔助化療的治療效果，對實施后續(xù)個體化治療至關重要。本研究結果顯示，新輔助化療前，癌旁組織CD8+CTL高表達、卵巢癌組織FOXP3+Treg低表達是ORR的影響因素。表明新輔助化療前，患者腫瘤局部免疫反應越高，對新輔助化療敏感性越高。

綜上所述，晚期卵巢癌患者腫瘤局部組織FOXP3+細胞浸潤狀態(tài)可作為新輔助化療敏感性的有效預測指標，且新輔助化療后患者腫瘤局部組織FOXP3+低表達可能與實現(xiàn)pCR密切相關。目前，臨床采用單抗抑制T細胞免疫抑制及腫瘤局部的免疫抑制狀態(tài)，以期提高機體的免疫反應，治療效果較理想。但仍需進一步探討腫瘤患者在接受新輔助化療前，是否可先給予某種單抗以提高其對化療的敏感性。