田浩，馬翾，高峽

宜昌市第二人民醫(yī)院（腫瘤醫(yī)院）腫瘤外科，湖北 宜昌 4430000

近年胃癌的發(fā)病率明顯升高，流行病學(xué)研究證實(shí)，中國部分地區(qū)胃癌的發(fā)病率可達(dá)（272～383）/10萬人[1]。臨床上胃癌的發(fā)生可以導(dǎo)致患者致殘率和病死率升高，導(dǎo)致患者不良臨床結(jié)局的發(fā)生[2]。不同的腫瘤相關(guān)蛋白均可以促進(jìn)胃癌的發(fā)生，影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特征，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的浸潤、增殖及黏附能力的改變。原鈣粘蛋白（protocadherin 10，PCDH10）表達(dá)水平的改變，可以影響下游腫瘤信號(hào)通路的激活，提高p53抑癌基因的活性，并可以穩(wěn)定腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期，進(jìn)而抑制腫瘤的早期發(fā)生和中晚期病情進(jìn)展。部分研究者報(bào)道了PCDH10在胰腺癌等惡性腫瘤中的表達(dá)情況，認(rèn)為PCDH10表達(dá)水平的下降是促進(jìn)胰腺惡性腫瘤進(jìn)展的重要因素[3]，但對(duì)于PCDH10表達(dá)與胃癌關(guān)系的研究不足。為了揭示PCDH10表達(dá)與胃癌臨床特征的關(guān)系，本研究收集手術(shù)后胃癌組織標(biāo)本90例，分析PCDH10蛋白的表達(dá)情況及其與患者臨床特征、預(yù)后的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本選取

選取2013年6月至2014年12月宜昌市第二人民醫(yī)院手術(shù)后胃癌組織標(biāo)本和癌旁組織標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)術(shù)后病理學(xué)檢查確診為胃癌；②術(shù)前無放化療史；③患者的臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：轉(zhuǎn)移性胃癌。根據(jù)納入、排除標(biāo)準(zhǔn)，分別選取術(shù)后胃癌組織標(biāo)本90例和癌旁組織標(biāo)本45例。胃癌組織對(duì)應(yīng)患者的年齡為37～73歲，平均年齡為（57.5±12.1）歲；男52例，女38例；Lauren分型[4]：腸型33例，彌漫型57例；分化程度：高分化19例，中分化28例，低分化43例；TNM分期：I期24例，Ⅱ期29例，Ⅲ期37例。癌旁組織對(duì)應(yīng)患者的年齡為42～70歲，平均年齡為（55.8±10.1）歲；男25例，女20例。兩組患者的年齡、性別比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 免疫組化法及結(jié)果判定

所有組織標(biāo)本均經(jīng)石蠟包埋后連續(xù)切片，厚度約為4 mm，采用免疫組化鏈霉抗生物素蛋白-生物素-過氧化物酶復(fù)合物法（streptavidin-biotin-peroxidase complex method，SABC）染色，二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色。PCDH10蛋白通用型二抗、SP試劑盒、DAB顯色盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)開發(fā)公司。以陽性片及磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）代替一抗分別作為陽性及陰性對(duì)照，高倍顯微鏡下觀察PCDH10蛋白的表達(dá)情況，具體染色步驟嚴(yán)格按照SP試劑盒說明書進(jìn)行操作。

免疫組化的結(jié)果判定：PCDH10蛋白的陽性著色表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，呈黃色、棕黃色、褐色。根據(jù)著色強(qiáng)度評(píng)分：0分為無色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為褐色、黑色。根據(jù)陽性細(xì)胞比例評(píng)分：1分為陽性細(xì)胞比例≤10%，2分為陽性細(xì)胞比例占11%～50%，3分為陽性細(xì)胞比例占51%～75%，4分為陽性細(xì)胞比例＞75%。兩種評(píng)分相乘得分＜3分為陰性，≥3分為陽性。

1.3 蛋白質(zhì)印跡法

將蛋白樣品與上樣緩沖液以5∶1的比例混合，80～100℃煮沸5 min。根據(jù)蛋白相對(duì)分子質(zhì)量不同，配制并灌注相應(yīng)的12%分離膠和5%濃縮膠，按照15 g/孔蛋白量進(jìn)行組織蛋白的上樣，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDSPAGE）。電泳后根據(jù)條帶切膠，半濕法轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）封閉2 h，加入含10%的BSA一抗及二抗（1∶1000），PBS清洗3次，每次5 min，進(jìn)行曝光及膠片弧度的讀取。

1.4 隨訪

對(duì)兩組患者進(jìn)行隨訪觀察，隨訪時(shí)間≥3年，主要通過電話、信件和患者主動(dòng)到本院門診接受隨診復(fù)查的方式完成。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16-.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PCDH10表達(dá)情況分析

胃癌組織中PCDH10陽性表達(dá)率為32.22%（29/90），明顯低于癌旁組織的84.44%（38/45），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=32.728，P＜0.01）。胃癌組織中PCDH10相對(duì)表達(dá)量為（0.204±0.085），明顯低于癌旁組織的（0.693±0.173），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=22.064，P＜0.01）（圖1）。

圖1 胃癌組織與癌旁組織中PCDH10蛋白質(zhì)印跡檢測結(jié)果

2.2 不同臨床特征的胃癌患者胃癌組織的PCDH10表達(dá)情況

TNM分期為I～Ⅱ期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌患者胃癌組織的PCDH10陽性表達(dá)率高于TNM分期為Ⅲ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.370、6.420，P=0.007、0.011）；不同年齡、性別、腫瘤直徑、Lauren分型、分化程度的胃癌患者胃癌組織的PCDH10陽性表達(dá)率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（表1）

2.3 胃癌組織中PCDH10表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系

隨訪3年，PCDH10陽性表達(dá)患者失訪1例，死亡10例；PCDH10陰性表達(dá)患者失訪3例，死亡36例。PCDH10陽性表達(dá)患者的3年生存率為62.1%（18/29），高于PCDH10陰性表達(dá)患者的36.1%（22/61），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.272，P=0.022）。

3 討論

胃癌的病情進(jìn)展較隱匿，雖然早期可能有上腹不適的臨床癥狀，但疾病的總體早期診斷水平較低[4-8]。胃癌的治療效果仍不能令人滿意。因此，關(guān)于胃癌患者的臨床病理特點(diǎn)及診療一直是研究的熱點(diǎn)[9-12]。本研究分析胃癌組織中PCDH10的表達(dá)情況及其與胃癌臨床特征、預(yù)后的關(guān)系，不僅可以為胃癌發(fā)病機(jī)制的研究提供參考，也可以為胃癌的診斷提供潛在的臨床指標(biāo)。

表1 不同臨床特征的胃癌患者胃癌組織的PCDH10表達(dá)情況（n=90）

PCDH10蛋白的表達(dá)在惡性腫瘤的發(fā)生過程中發(fā)揮了重要的作用，其參與腫瘤細(xì)胞代謝、細(xì)胞周期調(diào)控及細(xì)胞凋亡等過程。PCDH10表達(dá)水平的改變可以阻斷腫瘤信號(hào)通路，抑制下游腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的活性，降低腫瘤細(xì)胞DNA的擴(kuò)增速度。PCDH10蛋白可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞膜表面糖蛋白配體的激活，影響細(xì)胞周期調(diào)控依賴性蛋白激活的轉(zhuǎn)錄活性，降低上皮細(xì)胞持續(xù)性擴(kuò)增的風(fēng)險(xiǎn)[13]。近年相關(guān)基礎(chǔ)方面的研究顯示，PCDH10蛋白對(duì)腫瘤上皮細(xì)胞形態(tài)有維持作用，可以降低腫瘤細(xì)胞的變形能力，使腫瘤細(xì)胞浸潤和轉(zhuǎn)移的能力下降[14]。部分研究者報(bào)道了PCDH10蛋白在消化系統(tǒng)惡性腫瘤中的異常表達(dá)情況，認(rèn)為PCDH10蛋白的表達(dá)水平下降與肝癌或者胰腺癌的發(fā)生有一定的關(guān)聯(lián)[14]，但對(duì)于PCDH10蛋白的表達(dá)與胃癌患者臨床特征關(guān)系的研究不多。

本研究免疫組化的結(jié)果分析可見，PCDH10蛋白在胃癌組織中的相對(duì)表達(dá)量和陽性表達(dá)率均明顯低于癌旁組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），提示PCDH10蛋白的表達(dá)缺失可能是促進(jìn)胃癌發(fā)生發(fā)展的重要因素。胃癌組織中PCDH10蛋白表達(dá)水平下降主要與下列兩個(gè)因素有關(guān)：①PCDH10蛋白的表達(dá)缺失導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞浸潤能力提高，使腫瘤細(xì)胞更易突破基底膜組織；②PCDH10蛋白的表達(dá)水平下降，導(dǎo)致其對(duì)腫瘤細(xì)胞周期的調(diào)控作用減弱，腫瘤細(xì)胞增殖速度明顯加快。本研究在分析不同臨床特征的胃癌患者PCDH10蛋白表達(dá)變化時(shí)發(fā)現(xiàn)，臨床分期較晚或者有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者PCDH10蛋白的陽性表達(dá)率下降，提示PCDH10蛋白的表達(dá)與胃癌患者的臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關(guān)，這主要是由于PCDH10蛋白的表達(dá)缺失可以影響胃黏膜上皮細(xì)胞對(duì)鄰近正常組織的浸潤能力，導(dǎo)致疾病進(jìn)展，而PCDH10蛋白的表達(dá)缺失還可以影響淋巴結(jié)的黏附分子的波動(dòng)。部分研究者認(rèn)為Lauren分型與胃癌組織中PCDH10蛋白相關(guān)，本研究并未得出相同結(jié)論，考慮可能與PCDH10蛋白檢測靈敏度的差別有關(guān)。生存預(yù)后的分析可見，PCDH10蛋白陽性表達(dá)的胃癌患者3年生存率高于PCDH10蛋白陰性表達(dá)的患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示PCDH10蛋白對(duì)胃癌患者的生存預(yù)后有影響。本研究的創(chuàng)新性亦在于探討了PCDH10蛋白與胃癌患者臨床預(yù)后的關(guān)系。

綜上所述，PCDH10表達(dá)水平下降可能在促進(jìn)胃癌的發(fā)生過程中發(fā)揮了重要的作用，同時(shí)PCDH10表達(dá)水平下降可以增加患者生存預(yù)后惡化的風(fēng)險(xiǎn)。