劉學(xué)剛，劉艷彩，吳春平，李景光，趙嶺嶺，張振亞#

衡水市第四人民醫(yī)院1普外科，2病理科，河北 衡水 0530000

結(jié)腸癌是目前最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率一直居高不下。多項(xiàng)研究均證明，在結(jié)腸癌的發(fā)生與發(fā)展中，WNT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮了重要的作用[1-2]。WNT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是由一系列癌基因和抑癌基因編碼的蛋白質(zhì)組成，在調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育、細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)及細(xì)胞調(diào)亡等過程中發(fā)揮了顯著作用[3]。腫瘤轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致結(jié)腸癌患者病死率較高的主要原因之一[4]，研究表明，CD151在腫瘤的轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要的作用[5]。CD151屬于4次跨膜結(jié)構(gòu)超家族（transmembrane 4 superfamily，TM4SF）成員之一，是TM4SF中唯一的癌基因，能夠促進(jìn)細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)，腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，并且能夠通過穩(wěn)定新生血管的結(jié)構(gòu)，為腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移提供必要條件[6]。然而目前CD151與WNT信號(hào)通路的關(guān)系少見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過比較裸鼠移植瘤中的人結(jié)腸癌細(xì)胞HT29、敲除CD151基因的HT29細(xì)胞（CD151－-HT29）的β-catenin基因及蛋白的表達(dá)變化，探究CD151對結(jié)腸癌細(xì)胞WNT信號(hào)通路的影響機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及細(xì)胞

RPMI1640培養(yǎng)基購自杭州四季青生物工程材料有限公司，胰蛋白酶購自上海源葉生物科技有限公司，二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司，熒光二抗購自廣州華拓生物科技有限公司，β-catenin抗體以及β-actin抗體均購自美國Abcam公司。HT29細(xì)胞以及CD151－-HT29細(xì)胞均購自上海信裕生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

20只BALB/c-nu/nu雄性裸鼠[購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，SCXK（滬）2012-0002）]，體重（22±2）g，在無菌環(huán)境中飼養(yǎng)，裸鼠所用飼料、飲用水、墊料均經(jīng)過高壓滅菌處理。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法及觀察指標(biāo)

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 從-80℃冰箱中取出HT29和CD151－-HT29細(xì)胞凍存管，放在37℃恒溫水浴鍋中快速解凍，將解凍好的細(xì)胞快速放入事先準(zhǔn)備好的裝有10 ml RPMI1640培養(yǎng)基的15 ml離心管中，離心去上清，重新加入5 ml新培養(yǎng)基，用吹打管小心吹打混勻細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至100 cm3的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)足培養(yǎng)液，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞長滿至80%時(shí)，即可傳代培養(yǎng)，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 荷瘤鼠模型的建立 將狀態(tài)良好的裸鼠隨機(jī)分為兩組，每組10只，分別設(shè)為對照組及觀察組，對照組裸鼠注入HT29細(xì)胞，觀察組裸鼠注入CD151－-HT29細(xì)胞。建模前需要將處于對數(shù)生長期的HT29、CD151－-HT29細(xì)胞用胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞，再用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）使細(xì)胞重新分散，細(xì)胞終濃度為1×107/ml。將準(zhǔn)備好的細(xì)胞懸液注射入裸鼠腋下，一切操作在無菌環(huán)境下進(jìn)行。1周后可明顯觀察到腫瘤形成，3周后處死裸鼠，取出腫瘤組織，放入-20℃冰箱中保存，備用。

1.3.3 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳和蛋白質(zhì)印跡（Western blot）技術(shù)檢測蛋白表達(dá)水平采用Western blot技術(shù)檢測HT29、CD151－-HT29細(xì)胞形成的腫瘤組織中CD151、β-catenin和β-actin蛋白表達(dá)情況。具體操作步驟如下：先制備分離膠、濃縮膠，待濃縮膠凝固后，豎直向上拔起齒梳；將計(jì)算好體積的蛋白樣品通過移液槍轉(zhuǎn)入至加樣孔中，開始電泳，待電泳結(jié)束后，開始轉(zhuǎn)膜，再與抗體發(fā)生免疫反應(yīng)，最后放入至電化學(xué)發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL）試劑盒中顯色及顯影。將膠片放入凝膠成像系統(tǒng)中拍照，用Quantity One圖像分析軟件分析目標(biāo)條帶的分子量和光密度值。

1.3.4 免疫組化技術(shù)檢測蛋白表達(dá)情況 采用免疫組化技術(shù)檢測腫瘤組織中Wnt1a蛋白、Oct4蛋白的表達(dá)情況。將離體不超過30 min的腫瘤組織置入4%的多聚甲醛中固定24 h，取固定后的腫瘤組織依次經(jīng)30%、50%、70%、80%及90%的梯度乙醇脫水，每次30 min。再用二甲苯脫乙醇，20 min后放入石蠟中包埋。將制備好的腫瘤組織石蠟切片分別采用100%、95%及80%的乙醇進(jìn)行脫蠟，放入3%H2O2溶液中孵育5～10 min，以滅活內(nèi)源性過氧化物酶。使用蒸餾水沖洗，抗原修復(fù)，PBS沖洗3次，滴加一抗，室溫孵育2 h，PBS沖洗3次，二抗孵育20 min后，再用PBS沖洗3次。DAB染色，染到適宜程度時(shí)，使用蒸餾水沖洗終止染色，蘇木精染色1 min，1%鹽酸乙醇浸泡30 s，1%氨水乙醇浸泡45 s，再分別用85%、90%及100%梯度乙醇各處理切片1 min，二甲苯透化2次。根據(jù)陽性細(xì)胞（以出現(xiàn)灰黃色、金黃色或棕黃色顆粒記為陽性細(xì)胞）所占比例及染色強(qiáng)度對切片共同評分，即采用雙評分半定量法。根據(jù)陽性細(xì)胞所占比例，將切片劃分為4個(gè)等級：＜25%為1分，25%～49%為2分，50%～75%為3分，＞75%為4分；根據(jù)切片的染色強(qiáng)度，將切片劃分為4個(gè)等級：基本無色為0分，淺黃色為1分，黃色為2分，棕褐色為3分。將兩種評分相加得最終總分，總分≤3分為陰性，總分＞3分則為陽性。分別對腫瘤組織中的Wnt1a蛋白、Oct4蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行初步評估。

1.3.5 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)檢測基因表達(dá)情況 采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）技術(shù)檢測HT29、CD151－-HT29細(xì)胞形成的腫瘤組織中β-catenin基因的表達(dá)情況。將取出的腫瘤組織勻漿，向其中加入1 ml的TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA，反復(fù)吹打使細(xì)胞從培養(yǎng)瓶壁上完全脫落。將培養(yǎng)瓶中剩余液體全部轉(zhuǎn)移至EP管中，勻漿，離心取上清轉(zhuǎn)移至新EP管中，向其中加入0.5 ml異丙醇，混勻后在室溫下放置10 min，離心后可在EP管的底部和側(cè)壁上觀察到膠狀沉淀，即為RNA，棄去上清，加入1 ml 75%乙醇對RNA沉淀進(jìn)行漂洗后離心收集純凈的RNA，室溫下干燥，放于-80℃下保存?zhèn)溆谩Ｃ?0 μl反轉(zhuǎn)錄體系中加入1 μl的RNA，振蕩搖勻，短暫離心富集RNA，將EP管放入至自動(dòng)PCR儀中檢測基因表達(dá)情況。以βactin作為內(nèi)參，β-actin上游引物序列為5'-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3'，下游引物序列為5'-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3'；β-catenin上游引物序列為5'-TTGAAAATCCAGCGTGGACA-3'，下游引物序列為5'-TCGAGTCATTGCATACTGTC-3'。

最終采用2-△△Ct法計(jì)算目的基因的表達(dá)量。計(jì)算公式：△Ct=Ct目的基因-Ctβ-actin，△△Ct=△Ct觀察組-△Ct對照組。2-△△Ct表示觀察組目的基因的表達(dá)相對于對照組的變化倍數(shù)，當(dāng)2-△△Ct＞1時(shí)，表明觀察組目的基因水平高于對照組，基因表達(dá)上調(diào)；當(dāng)2-△△Ct=1時(shí)，表明觀察組目的基因水平等于對照組，基因表達(dá)未發(fā)生改變；當(dāng)2-△△Ct＜1時(shí)，表明觀察組目的基因水平低于對照組，基因表達(dá)下調(diào)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)-計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CD151、β-catenin和β-actin蛋白表達(dá)情況的比較

采用Western blot技術(shù)分別檢測對照組和觀察組裸鼠腫瘤組織中CD151、β-catenin和β-actin蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示對照組裸鼠腫瘤組織中存在明顯的CD151、β-catenin和β-actin蛋白的表達(dá)，而觀察組裸鼠腫瘤組織中并不存在CD151蛋白的表達(dá)（圖1），證明CD151-荷瘤鼠模型建立成功。在此基礎(chǔ)上，對兩組裸鼠腫瘤組織中的β-catenin相對表達(dá)量（與β-actin的比值）進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，對照組β-catenin相對表達(dá)量為（0.18±0.02），與觀察組的（0.13±0.01）比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 Western blot技術(shù)檢測兩組裸鼠腫瘤組織中CD151、β-catenin和β-actin蛋白的表達(dá)情況

2.2 Wnt1a、Oct4蛋白表達(dá)情況的比較

采用免疫組化法分別檢測對照組和觀察組裸鼠腫瘤組織中Wnt1a蛋白、Oct4蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示觀察組裸鼠的腫瘤組織中Wnt1a蛋白、Oct4蛋白表達(dá)量均低于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（圖2、表1）

圖2 免疫組化法檢測兩組裸鼠腫瘤組織中Wnt1a、Oct4蛋白表達(dá)情況（SP染色，×200）

表1 兩-組腫瘤組織中Wnt1a、Oct4蛋白表達(dá)情況的比較（x±s）

2.3 β-catenin mRNA相對表達(dá)量的比較

采用qRT-PCR技術(shù)檢測對照組與觀察組裸鼠腫瘤組織中β-cateninmRNA的表達(dá)情況，對照組β-cateninmRNA的表達(dá)量為（1.01±0.05），明顯高于觀察組的（0.43±0.04），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=22.188，P＜0.01）。

3 討論

隨著人類社會(huì)的發(fā)展和生活水平的不斷提高，結(jié)腸癌的發(fā)病率也在逐年升高，目前臨床上治療結(jié)腸癌的主要手段為手術(shù)切除腫瘤部位，但是在患者手術(shù)前，腫瘤很可能已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移，因此腫瘤無法得到根除并且復(fù)發(fā)率高[7-8]。目前，探究腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及轉(zhuǎn)移機(jī)制已經(jīng)成為治療結(jié)腸癌的熱點(diǎn)問題，如何抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移很可能會(huì)成為結(jié)腸癌治療的下一個(gè)突破口。

眾所周知，腫瘤的轉(zhuǎn)移機(jī)制十分復(fù)雜，目前有研究表明，腫瘤的轉(zhuǎn)移與腫瘤內(nèi)部微血管的形成有關(guān)且與WNT信號(hào)通路密切相關(guān)[9-10]。WNT信號(hào)通路是由一系列癌基因以及抑癌基因編碼表達(dá)的蛋白質(zhì)組成，能夠抑制β-catenin的降解，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的β-catenin增多，引起T細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄水平提高，促進(jìn)多種靶基因激活，如原癌基因c-Jun、可異位基因c-myc和基質(zhì)金屬蛋白酶7（matrix metalloproteinase 7，MMP7）等，這些靶基因在腫瘤的生成、發(fā)展以及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要作用[11-13]。而CD151蛋白能夠促進(jìn)腫瘤血管的生成，并且能夠形成CD151-整合素復(fù)合體系統(tǒng)維持新生血管的穩(wěn)定[14-15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，觀察組裸鼠腫瘤組織中β-catenin蛋白及mRNA表達(dá)均有下降，初步推測CD151可能是WNT信號(hào)通路的上游基因，對WNT信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)有調(diào)控作用。本研究結(jié)果還表明，對照組裸鼠腫瘤組織中存在明顯的CD151蛋白表達(dá)，而觀察組腫瘤組織中并不存在CD151蛋白的表達(dá)，這一結(jié)果說明CD151基因缺失的結(jié)腸癌荷瘤鼠模型建立成功。采用Western blot技術(shù)檢測β-catenin和β-actin蛋白的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)觀察組裸鼠腫瘤組織中的β-catenin相對表達(dá)量低于對照組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能與樣本量較少有關(guān)。當(dāng)WNT信號(hào)通路尚未被激活時(shí)，β-catenin蛋白能夠維持細(xì)胞上皮的完整性，降低腫瘤轉(zhuǎn)移成功率，一旦WNT信號(hào)通路被激活，β-catenin蛋白在細(xì)胞核中大量表達(dá)并發(fā)生集聚，從而失去維持細(xì)胞上皮完整性的功能，并且β-catenin蛋白能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)[16-17]。本研究結(jié)果同樣發(fā)現(xiàn)，對照組裸鼠腫瘤組織中Oct4蛋白表達(dá)量高于觀察組。Oct4蛋白在維持干細(xì)胞的正常功能以及自我更新中發(fā)揮了重要的作用，也是WNT信號(hào)通路中的重要成員[18-19]。

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移之間的機(jī)制構(gòu)成了一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)體系。目前，WNT信號(hào)通路的作用機(jī)制及相互作用也并未全部詮釋出來，本文從研究CD151與WNT信號(hào)通路之間關(guān)聯(lián)的角度出發(fā)，以期能夠揭示結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展過程，為臨床上結(jié)腸癌的治療尋找新的突破口。