翟健，胡萬寧，李軍，石福民

唐山市人民醫(yī)院頭頸外科，河北 唐山 0630010

甲狀腺癌是內(nèi)分泌系統(tǒng)較為常見的一種惡性腫瘤，其發(fā)病率逐年增加，約占全身惡性腫瘤的3%，約占頭頸部惡性腫瘤的5%[1]。據(jù)報道，全球甲狀腺癌的發(fā)病率女性是男性的3.57倍[2]。目前，甲狀腺癌的治療手段主要包括手術(shù)治療、內(nèi)分泌治療和131I治療等，但治療后易出現(xiàn)復(fù)發(fā)[3]。因此，尋找新的方法改善腫瘤的治療和預(yù)后具有重要意義。腫瘤的發(fā)生是一個復(fù)雜的過程，受多種因素的影響，如癌基因和抑癌基因的異常表達(dá)等均可導(dǎo)致細(xì)胞的惡性增殖，嚴(yán)重威脅人類的生命健康。細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1A（cyclindependent kinase inhibitor 1A，P21）可以抑制周期蛋白依賴性激酶的活性，對細(xì)胞周期發(fā)揮調(diào)控作用。相關(guān)研究表明，P21在細(xì)胞增殖過程中DNA的損傷、修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用，P21過表達(dá)可以使細(xì)胞周期停滯在G1、G2或S期[4-5]。目前，關(guān)于P21在甲狀腺癌中作用機(jī)制的研究相對較少，因此本研究通過過表達(dá)P21基因，探討P21基因過表達(dá)對甲狀腺癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響及其作用機(jī)制，旨在為甲狀腺癌的診斷、治療及預(yù)后提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

人甲狀腺癌細(xì)胞系SW579購自美國菌種保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）細(xì)胞庫，胎牛血清（fetal calf serum，F(xiàn)BS）、L-15培養(yǎng)基、脂質(zhì)體Lipofectamine 2000均購自美國Invitrogen公司，噻唑藍(lán)（methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，膜聯(lián)蛋白V（Annexin V）-異硫氰酸熒光素（FITC）/碘化丙錠（PI）細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自上海翊圣生物科技有限公司，P21抗體購自美國BD公司，B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2）抗體、Bcl-2相關(guān)X蛋白（B cell lymphoma/leukemia-2 associated X protein，BAX）抗體、細(xì)胞周期蛋白D1（cyclin D1）抗體均購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將SW579細(xì)胞凍存管迅速置于37℃水浴中，不?；蝿邮辜?xì)胞盡快融化，800 r/min離心5 min，收集細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)于含10%FBS和青鏈霉素的L-15培養(yǎng)基中，置于5%CO2、37℃飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。采用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，按1∶3的比例每3～4天傳代1次。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

取生長狀態(tài)良好的對數(shù)期SW579細(xì)胞，采用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，采用不含抗生素的L-15培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，以2×105/孔細(xì)胞加入6孔板中，置于CO2孵箱中培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞覆蓋率為90%～95%時，將細(xì)胞分為對照組（未轉(zhuǎn)染）、PCLneo-HK組（轉(zhuǎn)染空載體PCLneo-HK）和PCLneo-P21組（轉(zhuǎn)染真核過表達(dá)載體PCLneo-P21）。具體轉(zhuǎn)染方法：將4 μg PCLneo-HK或PCLneo-P21質(zhì)粒與10 μl Lipofectamine 2000混合液加入培養(yǎng)板中，在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h，然后將培養(yǎng)基更換為含血清與雙抗的培養(yǎng)基，采用蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測轉(zhuǎn)染效果。

1.4 MTT法檢測細(xì)胞增殖活力

取SW579細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至2×103/ml，將細(xì)胞接種于96孔板中，按照不同分組（對照組、PCLneo-HK組、PCLneo-P21組）分別處理后置于孵育箱中培養(yǎng)48 h，每孔加入20 μl 5 mg/ml MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后終止，小心棄去上清液，加入150 μl二甲基亞砜，振蕩混勻10 min，使結(jié)晶物充分溶解，置于酶聯(lián)免疫檢測儀上檢測各孔在490 nm處的光密度值（optical density，OD），每組織5個復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，處理組與對照組OD值的比值為細(xì)胞的增殖率。

1.5 流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞的凋亡情況

取1×105個SW579細(xì)胞接種于6孔板上，按照不同分組（對照組、PCLneo-HK組、PCLneo-P21組）培養(yǎng)48 h后，采用胰蛋白酶消化，離心，收集細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）清洗2次，采用1×binding buffer重懸細(xì)胞，在凋亡檢測試劑說明書的指導(dǎo)下每孔加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI，振蕩混勻，常溫避光反應(yīng)10 min，置于流式細(xì)胞儀上檢測細(xì)胞凋亡率。

1.6 Western blot檢測細(xì)胞中 Bcl-2、BAX、cyclin D1蛋白的表達(dá)量

收集處理48 h后的對照組、PCLneo-HK組、PCLneo-P21組細(xì)胞，PBS清洗2次，加入細(xì)胞裂解液，12 000 r/min離心15 min，離心半徑30 cm，保存于-80℃中，Bradford法檢測蛋白濃度。取樣本蛋白與1×蛋白上樣緩沖液充分混合后，在100℃中變性5 min，將提前配置的10%的分離膠和5%的濃縮膠固定于蛋白電泳槽中，每孔加入30 μg蛋白樣品，90 V電泳至染料前沿進(jìn)入分離膠，將電壓提高至110 V，待溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠的底端時，停止電泳。切去多余凝膠，在轉(zhuǎn)移緩沖液中將蛋白凝膠轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，剪去多余部分，置于5～10 ml 5%脫脂牛奶封閉液中常溫作用1 h，TBST緩沖液洗膜2次，加入脫脂牛奶稀釋的一抗，4℃孵育過夜，TBST緩沖液室溫下清洗3次，每次10 min，加入辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的二抗，37℃持續(xù)振蕩60 min，TBST緩沖液室溫下清洗3次，每次10 min，滴加電化學(xué)發(fā)光顯色試劑，暗箱中曝光，Image J軟件觀察蛋白的灰度值，目的蛋白的相對表達(dá)量=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參蛋白條帶灰度值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟-件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 P21蛋白表達(dá)水平的比較

PCLneo-HK組SW579細(xì)胞中P21蛋白的相對表達(dá)量與對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；PCLneo-P21組SW579細(xì)胞中P21蛋白的相對表達(dá)量明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.989，P＜0.01）。（圖1、表1）

圖1 Western blot檢測SW579細(xì)胞中P21蛋白的表達(dá)水平

表1 不同組別SW579細(xì)胞中P21蛋白的表達(dá)水平（±s）

表1 不同組別SW579細(xì)胞中P21蛋白的表達(dá)水平（±s）

組別對照組PCLneo-HK組PCLneo-P21組P21蛋白相對表達(dá)量0.335±0.052 0.417±0.063 0.733±0.089

2.2 沉默P21表達(dá)對細(xì)胞增殖率的影響

PCLneo-HK組SW579細(xì)胞的增殖率與對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；PCLneo-P21組SW579細(xì)胞的增殖率明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.596，P＜0.01）。（表2）

表2 不同組別SW579細(xì)胞的增殖率（%，x-±s）

2.3 沉默P21表達(dá)對細(xì)胞凋亡能力的影響

PCLneo-HK組SW579細(xì)胞的凋亡率與對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；PCLneo-P21組SW579細(xì)胞的凋亡率明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=7.899，P＜0.01）。（圖2、表3）

圖2 流式細(xì)胞儀檢測SW579細(xì)胞的凋亡情況

表3 不同組別SW579細(xì)胞的凋亡率（%，±s）

表3 不同組別SW579細(xì)胞的凋亡率（%，±s）

組別 細(xì)胞凋亡率

2.4 沉默P21表達(dá)對細(xì)胞中Bcl-2、BAX、cyclin D1蛋白的影響

PCLneo-HK組SW579細(xì)胞中Bcl-2、BAX、cyclin D1蛋白的相對表達(dá)量與對照組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；PCLneo-P21組SW579細(xì)胞中Bcl-2、cyclin D1蛋白的相對表達(dá)量均明顯低于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.760、4.457，P＜0.01）；PCLneo-P21組SW579細(xì)胞中BAX蛋白的相對表達(dá)量明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.918，P＜0.01）。（圖3、表4）

圖3 Western blot檢測SW579細(xì)胞中Bcl-2、BAX、cyclin D1蛋白的表達(dá)情況

表4 不同組別SW5-79細(xì)胞中Bcl-2、BAX、cyclin D1蛋白的相對表達(dá)量（x±s）

3 討論

基因的穩(wěn)定性與細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡之間的相互作用，維持了細(xì)胞增殖的有序性，其中基因的穩(wěn)定性對細(xì)胞的增殖調(diào)控起到根本作用[6]。G1/S和G2/M轉(zhuǎn)換期是細(xì)胞周期中兩個重要的時期，若G1/S和G2/M兩個關(guān)鍵的轉(zhuǎn)換期失控，則會導(dǎo)致本來應(yīng)該終止增殖或凋亡的細(xì)胞重新進(jìn)入細(xì)胞分裂過程，導(dǎo)致細(xì)胞惡性增殖，腫瘤進(jìn)一步惡化[7]。P21是一個廣譜的細(xì)胞周期依賴性激酶抑制劑和細(xì)胞周期的負(fù)調(diào)控因子，可通過阻礙細(xì)胞周期G1/S期的轉(zhuǎn)化，從而抑制細(xì)胞的增殖及修復(fù)損傷的DNA或錯誤復(fù)制的DNA[8]。因此，通常情況下認(rèn)為P21屬于抑癌基因。相關(guān)研究表明，P21的表達(dá)水平與腫瘤的分化程度、浸潤深度、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)[9]；P21在甲狀腺癌組織中的表達(dá)水平低于正常甲狀腺組織[10]。本研究將過表達(dá)載體PCLneo-P21轉(zhuǎn)染至人甲狀腺癌細(xì)胞SW579中，結(jié)果顯示PCLneo-P21組SW579細(xì)胞中P21蛋白的相對表達(dá)量明顯高于對照組（P＜0.01）。

細(xì)胞周期蛋白（cyclin）及其信號因子可以維持細(xì)胞增殖、分裂過程的有序性，對細(xì)胞周期的調(diào)控起重要作用[11]。cyclin D1是調(diào)控細(xì)胞周期的關(guān)鍵蛋白，其表達(dá)水平增加可以縮短細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期的時間，從而促進(jìn)細(xì)胞的增殖[12]。相關(guān)研究表明，cyclin D1在甲狀腺癌患者腫瘤組織中的陽性表達(dá)率明顯高于癌旁正常組織，與甲狀腺癌的預(yù)后密切相關(guān)[13]。Bcl-2、BAX是調(diào)控細(xì)胞凋亡的重要基因，已有研究指出，Bcl-2是抗凋亡因子，BAX是促凋亡因子，兩者發(fā)生拮抗作用，共同調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、侵襲、遷移等過程[14]。細(xì)胞內(nèi)Bcl-2蛋白和BAX蛋白的表達(dá)水平及比例決定著細(xì)胞對凋亡因素的敏感性[15]。相關(guān)研究表明，甲狀腺癌組織中Bcl-2、BAX蛋白的表達(dá)水平均明顯增高，且均能夠參與細(xì)胞凋亡相關(guān)過程[16]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PCLneo-P21組SW579細(xì)胞的增殖率明顯低于對照組，凋亡率明顯高于對照組（P＜0.01），表明過表達(dá)P21基因可以抑制細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡，但其作用機(jī)制尚不清楚，因此，本研究通過Western blot檢測過表達(dá)P21基因的SW579細(xì)胞中凋亡調(diào)控相關(guān)的cyclin D1、Bcl-2、BAX蛋白的相對表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PCLneo-P21組SW579細(xì)胞中BAX蛋白的相對表達(dá)量較對照組明顯增加（P＜0.01），cyclin D1、Bcl-2蛋白的相對表達(dá)量較對照組明顯降低（P＜0.01），提示過表達(dá)P21基因可能是通過調(diào)控細(xì)胞周期蛋白和凋亡相關(guān)因子的表達(dá)來發(fā)揮作用。

綜上所述，過表達(dá)P21基因可以抑制甲狀腺癌細(xì)胞增殖，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其可能是通過阻止細(xì)胞周期的進(jìn)程，進(jìn)而抑制cyclin D1蛋白表達(dá)，下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)，增加BAX蛋白表達(dá)水平來實(shí)現(xiàn)的。