譚灝，楊偉晗，康永，劉聰，李祥

山西省中醫(yī)藥研究院，太原 0300120

惡性腫瘤已經(jīng)成為中國重要的公共衛(wèi)生問題，自2010年來，惡性腫瘤已經(jīng)超過心腦血管疾病，成為中國人群第一大死因。預(yù)計在未來幾十年內(nèi)，中國惡性腫瘤的發(fā)病和病死人數(shù)將呈持續(xù)上升趨勢[1]。臨床上化療通常作為腫瘤治療的輔助手段，配合手術(shù)治療、放療應(yīng)用。順鉑是典型的鉑類藥物之一，在臨床實踐中發(fā)現(xiàn)順鉑化療后患者會出現(xiàn)免疫功能減退、骨髓抑制、食欲下降等一系列不良反應(yīng)，這與中醫(yī)的正氣虛、脾氣虛所表現(xiàn)出的癥狀相似，此時應(yīng)用中西醫(yī)結(jié)合療法往往可以獲得良好的療效[2-3]。扶正固本顆粒有良好的臨床療效基礎(chǔ)，由黃芩、淫羊藿、女貞子、何首烏等8味中藥組成，具有益氣養(yǎng)陰、涼血解毒等功效，常用于放化療后氣陰兩虛兼熱毒癥合并用藥。本研究探討扶正固本顆粒聯(lián)合順鉑對荷瘤小鼠T細(xì)胞免疫功能的影響，旨在為扶正固本顆粒作為腫瘤化療輔助用藥的臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)，以期加大其用藥范圍，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 瘤株 S180腹腔積液瘤瘤株購自上海中喬新舟生物科技有限公司。

1.1.2 動物 昆明種小鼠120只，體重（10±2）g，雌雄各半，購自中國輻射防護(hù)研究院。

1.1.3 儀器 垂直凈化工作臺購自蘇州凈化設(shè)備有限公司，SC-3610低速離心機購自安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司，細(xì)胞培養(yǎng)箱購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司，AXIO HAL100電子顯微鏡購自上海成貫儀器有限公司，血球計數(shù)板購自江蘇康健華醫(yī)療用品有限公司，流式細(xì)胞儀Cytomics FC 500（COULTER TQ-Prep工作站）購自美國貝克曼庫爾特有限公司。

1.2 研究方法

1.2.1 建立荷瘤小鼠模型 S180小鼠瘤株經(jīng)腹腔接種方式傳代，連續(xù)傳代至第3代后，頸椎脫臼法處死后移入預(yù)先進(jìn)行消毒的凈化工作臺上，腹部皮膚消毒后切開，暴露腹腔，抽取腹腔積液放入無菌試管中，用血球計數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度至1×107/ml，每只小鼠右腋部皮下接種0.2 ml。每日觀察腫瘤生長情況，肉眼觀察及手觸判斷建模是否成功[4]。

1.2.2 動物分組及給藥 接種次日將荷瘤小鼠隨機分為6組：空白組，無任何處理；模型組：等體積蒸餾水灌胃；化療組：順鉑注射液（1 mg/kg）腹腔注射；低、中、高劑量組：順鉑注射液（1 mg/kg）腹腔注射聯(lián)合扶正固本顆粒（5.625、11.250、22.500 g/kg）灌胃給藥。每日給藥1次，共10天，全部建模完成，未見小鼠死亡。

1.2.3 小鼠生長情況的觀察 肉眼觀察各組小鼠的毛色、活動狀態(tài)，記錄體重變化及死亡情況。

1.3 觀察指標(biāo)及評價標(biāo)準(zhǔn)

給藥前及給藥結(jié)束稱量小鼠體重，對比體重的增長程度。小鼠末次給藥后24 h脫頸椎處死，迅速剝?nèi)∧[瘤、胸腺和脾臟并稱重，按下列公式計算抑瘤率、胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)。抑瘤率=（模型組平均腫瘤質(zhì)量-給藥組平均腫瘤質(zhì)量）/模型組平均腫瘤質(zhì)量×100%，胸腺（脾臟）指數(shù)=胸腺（脾臟）質(zhì)量（mg）/小鼠體重（g）×10。

末次給藥24 h后摘除眼球取血，收集血液，用流式細(xì)胞儀檢測荷瘤小鼠外周血中CD4+、CD8+、Th1細(xì)胞、Th2細(xì)胞、Th17細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cell，Treg）水平及 Th1/Th2、Th17/Treg 的比值變化。因?qū)嶒灢牧显?，此部分研究每組各抽取16只小鼠進(jìn)行實驗。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 24.0統(tǒng)計-軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠生長情況

除空白組外，各組荷瘤小鼠均出現(xiàn)不同程度的活動受限。模型組小鼠皮毛疏密及光澤程度與空白組比較無明顯變化；化療組小鼠瘤體縮小明顯，活動受限程度較模型組輕，但毛色暗淡，無光澤且皮毛稀疏；低、中、高劑量組小鼠毛色光亮，皮毛緊實，活動受限程度較模型組輕，較化療組重。實驗過程中未見小鼠死亡。

2.2 體重、瘤重、抑瘤率、胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)的比較

與模型組比較，化療組與低、中、高劑量組均能抑制小鼠的體重增長，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；低、中、高劑量組小鼠體重增長均多于化療組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）?；熃M與低、中、高劑量組小鼠瘤重均小于模型組小鼠，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；低、中劑量組小鼠瘤重均大于化療組小鼠，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。根據(jù)抑瘤率公式可計算出抑瘤率分別為化療組65.5%，低劑量組43.2%，中劑量組44.0%，高劑量組57.6%。化療組與低、中劑量組小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)均低于模型組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；中、高劑量組胸腺指數(shù)均高于化療組，低、中、高劑量組脾臟指數(shù)均高于化療組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。（表1）

表1 各組荷瘤小鼠體重增長、瘤重、胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)的比較（±s）

表1 各組荷瘤小鼠體重增長、瘤重、胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)的比較（±s）

注：a與模型組比較，P＜0.05；b與化療組比較，P＜0.05

組別空白組（n=20）模型組（n=20）化療組（n=20）低劑量組（n=20）中劑量組（n=20）高劑量組（n=20）F值P值體重增長（g）6.26±2.02 5.70±2.35-0.47±3.96a 1.99±1.40a b 3.14±2.52a b 4.77±2.39a b 27.134 26.029瘤重（g）—3.10±0.72 1.15±0.71a 2.21±0.93a b 2.14±0.58a b 1.34±0.40a 0.000 0.000胸腺指數(shù)31.90±7.23 28.48±3.49 15.05±2.55a 15.55±3.19a 16.48±4.93a b 21.08±3.29a b 9.489 1.533脾臟指數(shù)61.65±19.60 57.66±13.43 43.08±14.84a 46.99±17.35a b 48.36±16.73a b 58.03±13.33b 0.000 0.000

2.3 CD4+、CD8+水平的比較

與模型組比較，化療組小鼠血液中CD4+水平降低，CD8+水平提高，低劑量組小鼠CD8+水平提高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與化療組比較，中、高劑量組CD4+水平均提高，CD8+水平均降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。（表2）

表2 各組荷瘤小鼠CD4+、CD8+水平的比較（%，±s）

表2 各組荷瘤小鼠CD4+、CD8+水平的比較（%，±s）

注：a與模型組比較，P＜0.05；b與化療組比較，P＜0.05

組別空白組（n=16）模型組（n=16）化療組（n=16）低劑量組（n=16）中劑量組（n=16）高劑量組（n=16）F值P值CD4+31.13±9.12 30.86±9.26 25.70±3.68a 26.00±5.42 28.79±5.35b 29.44±7.34b 4.423 7.039 CD8+25.57±4.25 27.85±5.61 36.66±6.54a 35.23±6.14a 31.08±6.44b 29.99±4.77b 0.001 0.000

2.4 外周血中Th1、Th2、Th17、Treg水平的比較

與模型組比較，化療組小鼠外周血中Th1、Th17水平均降低，Treg水平提高，低、中劑量組小鼠外周血中Th1、Th17水平均降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與化療組比較，中、高劑量組小鼠外周血中Th1、Th17水平均提高，高劑量組Th2、Treg水平均降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。（表 3）

表3 各組荷瘤-小鼠外周血中Th1、Th2、Th17、Treg水平的比較（%，x±s）

2.5 外周血中Th1/Th2、Th17/Treg的比較

與模型組比較，化療組與低、中、高劑量組小鼠外周血中Th1/Th2均降低，化療組與低、中劑量組Th17/Treg均降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與化療組比較，低、中、高劑量組小鼠外周血中Th1/Th2均提高，高劑量組Th17/Treg水平提高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。（表4）

3 討論

腫瘤患者在進(jìn)行化療時需要營養(yǎng)支持，若沒有足夠的營養(yǎng)支持，一定程度上會成為死亡原因[5]。除了危重患者需要靜脈營養(yǎng)支持，在中國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的觀念中，經(jīng)過口-消化道攝取營養(yǎng)是對人體最好的，所以扶正固本顆粒能在一定程度上改善因營養(yǎng)攝取不足而導(dǎo)致病情惡化的情況。作為動物免疫系統(tǒng)的第一道防線，脾臟和胸腺的重量及免疫器官指數(shù)是反映實驗動物的非特異性免疫與特異性免疫的最基本指標(biāo)[6]，免疫功能減退小鼠的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)明顯低于正常小鼠。本實驗結(jié)果提示扶正固本顆粒聯(lián)合順鉑能提高荷瘤小鼠胸腺及脾臟指數(shù)，增強機體的免疫功能。CD4+是一類輔助性T細(xì)胞，活化后可釋放大量細(xì)胞因子，對細(xì)胞免疫起正調(diào)節(jié)作用，CD8+T細(xì)胞又被稱為抑制性T細(xì)胞，對細(xì)胞免疫起負(fù)調(diào)節(jié)作用[7-8]。本實驗結(jié)果提示中、高劑量扶正固本顆粒聯(lián)合順鉑能提高荷瘤小鼠CD4+水平，降低CD8+水平，反映中、高劑量扶正固本顆粒有利于動物體內(nèi)T細(xì)胞亞群增殖，以提高整體T細(xì)胞免疫功能。CD4+T細(xì)胞是重要的Th細(xì)胞，在免疫反應(yīng)的不同階段都會有CD4+T細(xì)胞的參與，根據(jù)其分泌細(xì)胞因子不同，可以分為Th1和Th2細(xì)胞亞群，Th1主要參與細(xì)胞免疫，通過分泌白細(xì)胞介素-2（interleukin-2，IL-2）、干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α），介導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)，提高免疫應(yīng)答；Th2細(xì)胞主要分泌IL-2、IL-6、IL-10等，主要參與體液免疫，起到免疫抑制作用。當(dāng)機體處于Th2細(xì)胞因子優(yōu)勢下，往往成為腫瘤免疫逃逸的原因。Th17細(xì)胞主要通過分泌IL-17、TNF-α活化中性粒細(xì)胞，并有研究表明，Th17細(xì)胞通過募集Th1細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)[9]。Treg細(xì)胞是一群具有免疫抑制作用的細(xì)胞群，Treg細(xì)胞數(shù)量增多也會增大腫瘤免疫逃逸的機會[10]。荷瘤小鼠外周血中Th1/Th2、Th17/Treg平衡被打破，優(yōu)勢傾向Th2、Treg一方，說明小鼠免疫功能被抑制，而這種抑制會導(dǎo)致腫瘤免疫逃逸的發(fā)生。本實驗中，高劑量扶正固本顆粒聯(lián)合順鉑能提高Th1/Th2、Th17/Treg比值。

表4 各-組荷瘤小鼠外周血中Th1/Th2、Th17/Treg的比較（x±s）

綜上所述，扶正固本顆粒能改善S180荷瘤小鼠化療后所出現(xiàn)的免疫抑制并有效改善食欲不振、體重減輕等常見不良反應(yīng)。