寧亞維，劉祥貴，王志新，賈英民

（1.河北科技大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院 /河北省發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，河北 石家莊 050018；2.北京工商大學(xué)食品學(xué)院，北京 102488；3.河北省雜糧研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/河北省農(nóng)林科學(xué)院，河北 石家莊 050035）

γ-氨基丁酸（γ-amino butyric acid，GABA）是一種非蛋白質(zhì)氨基酸，由谷氨酸經(jīng)谷氨酸脫羧酶催化而來，是哺乳動(dòng)物大腦抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，參與機(jī)體多重代謝活動(dòng)[1-7]。GABA天然存在于糧食原料中（如豆類、蕎麥、大麥、大米等），但含量均較低，然而可以通過環(huán)境條件脅迫、微生物發(fā)酵、蛋白質(zhì)水解結(jié)合酶催化等手段富集[8-12]，因此目前糧食作物中GABA的富集成為研究的熱點(diǎn)。

小米糙米在發(fā)芽過程中內(nèi)源酶 （如蛋白酶、谷氨酸脫羧酶等）被激活，可以催化谷氨酸進(jìn)行脫羧反應(yīng)生成GABA；相反，GABA也會(huì)在GABA轉(zhuǎn)氨酶的作用下分解生成琥珀酸半醛，因此只有谷氨酸脫羧酶的活性超過γ-氨基丁酸、丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶時(shí)，γ-氨基丁酸的含量才會(huì)增加[13-14]。不同的溫度、發(fā)芽時(shí)間等發(fā)芽條件會(huì)影響GABA的生成與降解平衡，只有適宜的條件才會(huì)使得小米糙米中的GABA得到有效富集[15]。因此，作者擬以GABA生成量為指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)結(jié)合響應(yīng)面優(yōu)化法探尋小米糙米發(fā)芽的最佳條件，以期獲得富集GABA的最佳工藝，為小米產(chǎn)品的開發(fā)提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冀谷：河北省農(nóng)林科學(xué)院谷物研究所提供；GABA標(biāo)準(zhǔn)品：購自Sigma-Aldrich公司；無水乙醇、苯酚、次氯酸鈉、四硼酸鈉、硼酸等均為分析純：購自天津市永大化學(xué)試劑有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

Evolution 220紫外分光光度計(jì)：美國Thermo公司產(chǎn)品；SIGMA3-18K高速冷凍離心機(jī)：德國SIGMA公司產(chǎn)品；Lab dancer漩渦振蕩器：德國IKA產(chǎn)品產(chǎn)品；SPX-150B-Z型生化培養(yǎng)箱：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠產(chǎn)品。GZX-9140MBE礱谷機(jī)：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 小米糙米發(fā)芽工藝 首先挑選顆粒飽滿的冀谷19號(hào)谷子進(jìn)行礱谷，人工去除雜質(zhì)及顆粒不完整的糙米，制備得到實(shí)驗(yàn)可用的小米糙米。然后采用蒸餾水清洗去除雜質(zhì)，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%的次氯酸鈉溶液浸泡30 min，再用無菌水清洗殘余次氯酸鈉對小米糙米進(jìn)行消毒處理。之后于試驗(yàn)設(shè)定條件下進(jìn)行浸泡與發(fā)芽，其中發(fā)芽階段每隔12 h采用無菌水淋洗一次。最后于80℃條件下干燥2 h，粉碎待用。

1.3.2 GABA的提取與測定 準(zhǔn)確稱取5.0 g小米糙米粉置于三角瓶中，首先加入15 mL無水乙醇提取糙米中的黃色素，于60℃水浴保溫2 h，然后于8 000 r/min離心20 min，上清液即為黃色素提取液，將其棄去留取沉淀物。向沉淀物中加入20 mL去離子水并置于震蕩水浴中提取GABA，在40℃的溫度下震蕩（150 r/min）提取1 h。然后將粗提取液于10 000 r/min條件下離心15 min，取上清液并定容至25 mL，所得溶液即為GABA提取液。

采用比色法測定GABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)。首先，量取0.4 mL提取液，向其中加入0.6 mL濃度為0.2 mol/L的硼酸緩沖液（pH 9.0）、2 mL苯酚溶液（體積分?jǐn)?shù)6%）和1 mL有效氯為質(zhì)量分?jǐn)?shù)9%的次氯酸鈉，震蕩均勻。然后于沸水浴加熱5 min，取出后立即置于冰浴中冷卻5 min，待出現(xiàn)藍(lán)綠色后加2 mL無水乙醇（體積分?jǐn)?shù)60%），震蕩均勻并測定645 nm處的吸光值。

1.3.3 發(fā)芽條件優(yōu)化與設(shè)計(jì)

1）單因素試驗(yàn) 小米糙米發(fā)芽試驗(yàn)中設(shè)定浸泡溫度、浸泡時(shí)間、發(fā)芽溫度和發(fā)芽時(shí)間4個(gè)因素，以發(fā)芽小米糙米中GABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為考察指標(biāo)進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

2）優(yōu)化試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取浸泡溫度、浸泡時(shí)間和發(fā)芽溫度3個(gè)主要影響為自變量，以GABA含量為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)3因素3水平響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)。其中3個(gè)自變量的范圍及水平編碼如表1所示。

表1 Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素水平及編碼Table 1 Factor level and code of Box-Behnken design

1.3.4 統(tǒng)計(jì)分析 采用origin 8.5進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及圖表繪制，采用Design-Expert 7.0統(tǒng)計(jì)軟件做方差分析與響應(yīng)面分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 浸泡溫度對GABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

分別設(shè)定小米糙米的浸泡溫度為：25、30、35、40℃，浸泡時(shí)間8 h，每隔2 h更換浸泡液一次，發(fā)芽溫度為30℃，發(fā)芽時(shí)間為48 h。小米發(fā)芽糙米的GABA含量如圖1所示?？梢钥闯?，浸泡液溫度在25到35℃之間，小米發(fā)芽糙米中的GABA含量隨著浸泡溫度的升高而增加，浸泡溫為在35℃時(shí)小米發(fā)芽糙米中的GABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到最大值78.60 mg/hg；當(dāng)浸泡溫度增加為40℃時(shí)，GABA小米發(fā)芽糙米中的含量不但沒有增加反而還有所降低。因此，實(shí)驗(yàn)將小米糙米發(fā)芽的最佳浸泡溫度選定為30～40℃。此外，未發(fā)芽的糙米GABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為21.90 mg/hg，此研究表明浸泡能夠顯著提高糙小米中GABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

圖1 浸泡溫度對GABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig.1 Effect of soaking temperature on the content of GABA

2.2 浸泡時(shí)間對GABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

分別設(shè)定浸泡時(shí)間為：0、4、8、12、16、20 h，浸泡液溫度為35℃，其他條件為發(fā)芽溫度30℃，發(fā)芽時(shí)間48 h。小米發(fā)芽糙米中GABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)如圖2所示。由圖2可知，隨著小米糙米浸泡時(shí)間的延長，小米發(fā)芽糙米中GABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈現(xiàn)先增加后減少的變化趨勢，當(dāng)浸泡時(shí)間為12 h時(shí)，GABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高可達(dá)101.15 mg/hg。因此，將小米糙米的最佳浸泡時(shí)間選定為8～16 h。

2.3 發(fā)芽溫度對GABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

分別設(shè)定發(fā)芽溫度為：25、30、35、40 ℃，浸泡液溫度為35℃，浸泡時(shí)間12 h，發(fā)芽時(shí)間為48 h。小米發(fā)芽糙米中GABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)如圖3所示。由圖3可知，在35℃之前，小米發(fā)芽糙米中GABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨溫度的升高而增加，在35℃時(shí)，小米發(fā)芽糙米中的GABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高為118.82 mg/hg，但溫度在超過35℃后，GABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨溫度的升高而降低。因此，選取最佳發(fā)芽溫度為30～40℃。

圖2 浸泡時(shí)間對GABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig.2 Effect of soaking time on the content of GABA

圖3 發(fā)芽溫度對GABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig.3 Effect of germination temperature on the content of GABA

2.4 發(fā)芽時(shí)間對GABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

分 別 設(shè) 定 發(fā) 芽 時(shí) 間 為 ：12、24、36、48、60、72、84、96、108、120 h，浸泡液溫度為 35 ℃，浸泡時(shí)間為12 h，發(fā)芽溫度為35℃。小米發(fā)芽糙米中GABA含量如圖4所示。由圖4可知，隨著小米糙米發(fā)芽時(shí)間的延長，GABA富集量逐漸增加，且在24 h到60 h之間GABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)增長迅速，當(dāng)發(fā)芽時(shí)間達(dá)到60 h時(shí)，GABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到峰值181.34 mg/hg。因此，選取最佳發(fā)芽時(shí)間為48～72 h。

2.5 響應(yīng)面分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)定浸泡溫度 30～40 ℃，浸泡時(shí)間 8～16 h，發(fā)芽溫度 30～40℃，發(fā)芽時(shí)間60 h，采用Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)法，優(yōu)化影響小米糙米富集GABA的關(guān)鍵工藝條件。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2，回歸模型方差分析見表3。

圖4 發(fā)芽時(shí)間對GABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig.4 Effect of germination time on the content of GABA

經(jīng)分析得到的小米糙米發(fā)芽條件與小米發(fā)芽糙米中GABA含量間的二次多項(xiàng)式回歸模型為：Y=178.74-17.20A+9.18B-21.27C+9.92AB-8.56AC-2.61BC-43.91A2-49.56B2-67.20C2，其中A為浸泡溫度，B為浸泡時(shí)間，C為發(fā)芽溫度。

由上述表3的方差分析結(jié)果可知，模型水平顯著，失擬項(xiàng)水平不顯著，表明本試驗(yàn)建立的回歸模型能真實(shí)地描述小米糙米在發(fā)芽過程的GABA含量與發(fā)芽條件之間的規(guī)律。其中C2對發(fā)芽小米糙米中GABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)影響極顯著，A2、B2對發(fā)芽小米糙米中GABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)影響顯著，AB、AC、BC發(fā)芽小米糙米中GABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)影響不顯著。因此，該模型可用于預(yù)測小米糙米在發(fā)芽中GABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Response surface design experiments and the corresponding GABA contents

通過優(yōu)化分析得到小米糙米發(fā)芽的最佳的工藝條件為浸泡溫度設(shè)定在34.14℃、浸泡時(shí)間設(shè)定12.32 h、發(fā)芽溫度設(shè)定為34.26℃，在上述條件下發(fā)芽60 h，小米發(fā)芽糙米中GABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)模型預(yù)測值為182.17 mg/hg。依據(jù)模型優(yōu)化結(jié)果與實(shí)際情況，浸泡溫度選定為34℃、浸泡時(shí)間選定為12 h、發(fā)芽溫度選定為34℃，發(fā)芽60 h對模型進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果小米發(fā)芽糙米中GABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為184.75 mg/hg，與預(yù)測值擬合度為101.42%，說明模型驗(yàn)證良好。該優(yōu)化工藝較優(yōu)化前提高了2.76倍，較未發(fā)芽前提高了8.44倍。因此，該研究表明優(yōu)化后的發(fā)芽工藝能夠有效地提高小米糙米中GABA的富集量。

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Analysis of variance（ANOVA） for response surface quadratic model

3 結(jié) 語

通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，確立了小米糙米富集GABA的發(fā)芽工藝條件：浸泡溫度34℃、浸泡時(shí)間12 h、發(fā)芽溫度34℃和發(fā)芽時(shí)間60 h，在此優(yōu)化條件下小米發(fā)芽糙米中GABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到184.75 mg/hg，較未發(fā)芽前提高了8.44倍。