李 耘，薛 峰，劉 健，楊維維，張 佳，鄭 波

(北京大學(xué)第一醫(yī)院臨床藥理研究所，北京 100034)

磷霉素(fosfomycin，C3H7PO4)是一種磷酸鹽衍生物，1969年美國(guó)MERCK公司和西班牙CEP公司從西班牙土壤中分離了幾種鏈霉菌(S.fradiae,S.wedomorensis和S.viridochromogenes)[1-2]，從其發(fā)酵液中得到了這種天然廣譜抗生素。2006年美國(guó)伊利諾伊大學(xué)成功將磷霉素合成的必需基因克隆到非原始宿主內(nèi)，獲得了磷霉素產(chǎn)量大幅增高的基因工程菌，使磷霉素得以人工合成，大規(guī)模用于臨床[3]。磷霉素作用于細(xì)菌細(xì)胞壁合成的早期階段，通過(guò)與催化肽聚糖合成的磷酸烯醇丙酮酸轉(zhuǎn)移酶(MurA)不可逆結(jié)合，抑制該酶活性，影響細(xì)胞壁合成發(fā)揮作用，屬繁殖期快速殺菌藥，對(duì)臨床常見(jiàn)革蘭陽(yáng)性菌和陰性菌均具有良好的抗菌活性，且與其他抗菌藥物無(wú)交叉耐藥性[4]。磷霉素具有以下特點(diǎn)：分子量小，穿透性好，體內(nèi)分布廣，幾乎不與血漿蛋白結(jié)合，血藥濃度高，不需肝代謝，不降解，大多數(shù)以原型經(jīng)腎排出體外，酶穩(wěn)定性好，用藥安全性高[5]。近年來(lái)，細(xì)菌耐藥性不斷加劇，磷霉素對(duì)多重耐藥菌仍有較好的抗菌活性，且與多種抗菌藥聯(lián)合應(yīng)用時(shí)呈現(xiàn)協(xié)同作用，因而備受重視[6]。本次試驗(yàn)評(píng)價(jià)磷霉素鈉聯(lián)合臨床常用抗菌藥物對(duì)醫(yī)院感染中常見(jiàn)病原菌金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌和銅綠假單胞菌的體外抗菌活性。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)藥品 注射用磷霉素鈉：批號(hào)4160419，規(guī)格 3.96 g/每瓶，東北制藥集團(tuán)沈陽(yáng)第一制藥有限公司產(chǎn)品；鹽酸左氧氟沙星：批號(hào)KYLH-M20091202B，效價(jià)86.8%，浙江普洛康裕制藥有限公司產(chǎn)品；鹽酸米諾環(huán)素：批號(hào)027M4012V，效價(jià)82.9%，SIGAM-ALDRICH公司產(chǎn)品；頭孢呋辛：批號(hào)130493-201105，效價(jià)92.1%；頭孢曲松：批號(hào)130480-201504，效價(jià)83.9%；苯唑西林：批號(hào)0482-9901，效價(jià)90.4%；克林霉素：批號(hào)0422-9502，效價(jià)85.5%；慶大霉素：批號(hào)130326-201015，效價(jià)63.0%；萬(wàn)古霉素：批號(hào)130360-201302，效價(jià)106.6%；頭孢他啶：批號(hào)130484-201205，效價(jià)85.7%，以上藥品購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院(或中國(guó)藥品生物制品檢定所)；亞胺培南：批號(hào)MO38098，效價(jià)43.2%，杭州默沙東制藥有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)菌株 標(biāo)準(zhǔn)菌株：金黃色葡萄球菌ATCC 29213，大腸埃希菌ATCC 25922，銅綠假單胞菌ATCC 27853。臨床分離菌331株，包括113株金黃色葡萄球菌，108株肺炎克雷伯菌和110株銅綠假單胞菌。每株細(xì)菌于試驗(yàn)前經(jīng)過(guò)平板轉(zhuǎn)種分純，以新鮮菌體用于試驗(yàn)。每次實(shí)驗(yàn)均用標(biāo)準(zhǔn)菌株作為藥敏敏感試驗(yàn)質(zhì)控菌，用不含抗菌藥物的平皿作為試驗(yàn)菌株生長(zhǎng)對(duì)照。

1.3 培養(yǎng)基與孵育條件 將16 mL 44℃左右的MH瓊脂培養(yǎng)基倒入已含1 mL不同濃度藥物的90 mm 培養(yǎng)皿，輕搖混勻。待凝固后，將細(xì)菌接種于培養(yǎng)皿上，35 ℃ 孵育16～20 h，讀取結(jié)果。

1.4 聯(lián)合最低抑菌濃度測(cè)定 藥物聯(lián)合采用棋盤法，最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration, MIC)測(cè)定采用標(biāo)準(zhǔn)瓊脂二倍稀釋法[7]。聯(lián)合抑菌濃度(fractional inhibitory concentration，F(xiàn)IC)根據(jù)公式FIC=(A藥聯(lián)合后MIC值/A藥單藥MIC值)+ (B藥聯(lián)合后MIC值/B藥單藥MIC值)計(jì)算，所得最低FIC值即FIC指數(shù)(FIC index，F(xiàn)ICI)。分別以兩種標(biāo)準(zhǔn)判定兩藥聯(lián)合后的關(guān)系：標(biāo)準(zhǔn)Ⅰ[8]：FICI≤0.5為協(xié)同，>0.5～1為相加，>1～2為無(wú)關(guān)，>2為拮抗。標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ[9]：FICI≤0.5為協(xié)同，>0.5～4為無(wú)關(guān)，>4為拮抗。

2 結(jié)果

2.1 磷霉素鈉及對(duì)照藥單藥藥敏結(jié)果 除萬(wàn)古霉素，磷霉素鈉及其他對(duì)照藥對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus, MRSA)的抗菌作用均較甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌(methicillin-susceptibleStaphylococcusaureus, MSSA)有所下降。對(duì)于碳青霉烯類抗生素敏感且不產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(extended-spectrum β-lactamases, ESBLs)肺炎克雷伯菌，磷霉素和對(duì)照藥均顯示出很好的體外抗菌活性。對(duì)于碳青霉烯類抗生素不敏感和ESBLs陽(yáng)性菌株，頭孢呋辛和頭孢曲松均高度耐藥，但磷霉素仍表現(xiàn)出一定抗菌活性，MIC50≤32 mg/L。對(duì)于銅綠假單胞菌，磷霉素對(duì)亞胺培南敏感或不敏感菌株的抗菌作用基本一致，但對(duì)照藥均受亞胺培南敏感性下降影響，對(duì)亞胺培南不敏感菌的抗菌活性低于敏感菌株。見(jiàn)表1。

表1 磷霉素鈉及對(duì)照藥對(duì)不同菌種的MIC結(jié)果(mg/L)Table 1 MICs of fosfomycin sodium and control antimicrobials against different strains (mg/L)

2.2 磷霉素鈉聯(lián)合藥敏結(jié)果 對(duì)于MRSA，磷霉素鈉與多個(gè)常用抗菌藥物表現(xiàn)出較好的協(xié)同作用，協(xié)同率>43%。此外，磷霉素鈉與苯唑西林、慶大霉素聯(lián)合，對(duì)MSSA也有較好協(xié)同作用，協(xié)同率>49%，但磷霉素鈉與慶大霉素聯(lián)合對(duì)MRSA的協(xié)同率僅5.2%，低于MSSA菌株。見(jiàn)表2。磷霉素鈉與頭孢呋辛、頭孢曲松聯(lián)合，對(duì)碳青霉烯敏感ESBLs陰性肺炎克雷伯菌的協(xié)同率高于對(duì)碳青霉烯不敏感的菌株。對(duì)于亞胺培南敏感銅綠假單胞菌，磷霉素與左氧氟沙星和頭孢他啶的協(xié)同率>60%，與阿米卡星協(xié)同率為36.4%；對(duì)于亞胺培南不敏感銅綠假單胞菌，磷霉素鈉與各藥物的協(xié)同作用弱于敏感菌株；但與亞胺培南聯(lián)合無(wú)論銅綠假單胞菌對(duì)亞胺培南是否敏感，其協(xié)同率均為41.8%。按照標(biāo)準(zhǔn)Ⅰ，磷霉素鈉與萬(wàn)古霉素聯(lián)合，對(duì)MSSA和MRSA均是相加或無(wú)關(guān)。對(duì)于ESBLs陽(yáng)性肺炎克雷伯菌和亞胺培南不敏感銅綠假單胞菌也以相加和無(wú)關(guān)為主。按照標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ，除協(xié)同外，均為無(wú)關(guān)。見(jiàn)表3。

表2 磷霉素鈉體外聯(lián)合其他藥物對(duì)金黃色葡萄球菌的藥敏結(jié)果[株數(shù)(%)]Table 2 In vitro susceptibility of S. aureus to fosfomycin sodium combined with other antimicrobial agents (No. of isolates[%])

表3 磷霉素鈉體外聯(lián)合其他藥物對(duì)肺炎克雷伯菌和銅綠假單胞菌的藥敏結(jié)果[株數(shù)(%)]Table 3 In vitro susceptibility of K. pneumoniae and P. aeruginosa to fosfomycin sodium combined with other antimicrobial agents (No. of isolates[%])

續(xù)表3 (Table 3, Continued)

3 討論

與磷霉素有關(guān)的聯(lián)合藥敏報(bào)道很多[6.10]，由于磷霉素獨(dú)特的作用機(jī)制及較好的抗菌活性，使得其從理論上具有更大的與其他抗菌藥物產(chǎn)生協(xié)同作用的可能。對(duì)于MRSA，磷霉素與頭孢孟多、頭孢唑林等多數(shù)頭孢類藥物，碳青霉烯類，米諾環(huán)素和利奈唑胺具有協(xié)同作用，協(xié)同率在50%以上；與青霉素類的協(xié)同率為10%～30%；而與慶大霉素、甲氧芐氨嘧啶的協(xié)同率小于10%；與夫西地酸、利福平、萬(wàn)古霉素在不同研究中結(jié)果不一致[6.10]。本研究中，磷霉素與苯唑西林對(duì)MRSA表現(xiàn)出較好的協(xié)同作用，協(xié)同率74.1%，優(yōu)于之前報(bào)道的18.7%[11]。

對(duì)于腸桿菌科細(xì)菌，近年來(lái)聯(lián)合藥敏研究多集中于產(chǎn)ESBLs及碳青霉烯類耐藥的肺炎克雷伯菌。多數(shù)研究顯示磷霉素與碳青霉烯類、氨曲南有協(xié)同作用；其次與氨基糖苷類、替加環(huán)素也有部分協(xié)同，但協(xié)同率多在50%以下；與多粘菌素協(xié)同率多在20%以下且有個(gè)別拮抗報(bào)道[10,12]。本研究結(jié)果顯示，對(duì)于產(chǎn)酶耐藥的肺炎克雷伯菌，磷霉素鈉與喹諾酮類，四環(huán)素類，第二、三代頭孢菌素協(xié)同率基本低于20%，提示針對(duì)此類耐藥菌，磷霉素與上述幾種抗菌藥物的聯(lián)合應(yīng)用協(xié)同效果有限。對(duì)于碳青霉烯類耐藥或多重耐藥銅綠假單胞菌，磷霉素與第三、四代頭孢菌素，氨曲南，碳青霉烯類，氨基糖苷類，喹諾酮類和多粘菌素等多種藥物均有聯(lián)合藥敏研究報(bào)道[10]，結(jié)果不盡相同。雖然磷霉素與上述藥物均有協(xié)同作用，但協(xié)同率通常低于50%。本研究中，對(duì)于亞胺培南不敏感銅綠假單胞菌，磷霉素與左氧氟沙星和亞胺培南有36.4%～41.8%的協(xié)同率。

對(duì)于聯(lián)合藥敏結(jié)果的判定，以往常用標(biāo)準(zhǔn)Ⅰ，即協(xié)同、相加、無(wú)關(guān)和拮抗4段法。但考慮到MIC測(cè)定為二倍稀釋法，同一株細(xì)菌的MIC值不同次測(cè)定時(shí)可能出現(xiàn) ±1個(gè)稀釋度的變化，因而，近年來(lái)國(guó)外較推崇標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ，即協(xié)同、無(wú)關(guān)和拮抗3段法[9]。本研究中將兩種判定結(jié)果均展示以供比較。已有的聯(lián)合藥敏報(bào)道顯示，研究者通常關(guān)注的是協(xié)同率與拮抗率，而兩種判定中協(xié)同標(biāo)準(zhǔn)是一致的，因此不同標(biāo)準(zhǔn)對(duì)最終定性影響不大。

磷霉素與其他抗菌藥物聯(lián)合應(yīng)用的臨床研究[13-15]顯示，對(duì)于碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌感染患者的治療也展現(xiàn)出較好的臨床效果。

總之，磷霉素鈉對(duì)臨床常見(jiàn)耐藥菌，如MRSA、產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌等仍有較好的抗菌作用，且與多種其他類抗菌藥物可產(chǎn)生協(xié)同作用，提示針對(duì)耐藥菌所致感染，在有限的治療手段中，含磷霉素的聯(lián)合用藥不失為一種選擇。如何采用簡(jiǎn)便的方法測(cè)定聯(lián)合藥敏，滿足臨床需求，也日益受到重視[16]。未來(lái)如能更深入地開展協(xié)同機(jī)制研究，并引入臨床數(shù)據(jù)，考察體外與臨床相關(guān)性，將對(duì)臨床聯(lián)合用藥的選擇更有指導(dǎo)意義。