鐘司 曾艷

摘 要：本文在行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《NY/761-2008蔬菜和水果中有機(jī)磷、有機(jī)氯、擬除蟲菊酯和氨基甲酸酯類農(nóng)藥多殘留的測(cè)定》用高效液相色譜法測(cè)定農(nóng)產(chǎn)品中氨基甲酸酯類農(nóng)藥的基礎(chǔ)上對(duì)色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化研究。通過(guò)更換流動(dòng)相及比例，建立了更高效的檢測(cè)10種氨基甲酸酯類農(nóng)藥條件。研究表明，優(yōu)化色譜條件后，色譜圖的基線更平穩(wěn)，組分保留時(shí)間平均縮短3.54min;在0.05-0.5mg/L范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)為1.0（除涕滅威亞砜為0.9975外），檢出限為0.001-0.007 mg/Kg;組分響應(yīng)大大提高，峰高是之前的1.65-4.14倍，峰面積是1.62-3.97倍，連續(xù)7次進(jìn)樣的保留時(shí)間、峰高、峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差比優(yōu)化前均有降低。優(yōu)化的檢測(cè)方法，快速簡(jiǎn)便，靈敏度高，準(zhǔn)確可靠，有效的提高了工作效率，能滿足農(nóng)產(chǎn)品中氨基甲酸酯類農(nóng)藥的液相檢測(cè)要求。

關(guān)鍵詞：甲醇;乙腈;高效液相色譜;氨基甲酸酯類農(nóng)藥

相對(duì)于有機(jī)磷殺蟲劑， 氨基甲酸酯類農(nóng)藥以其殘留低、選擇性強(qiáng)、對(duì)人畜毒性小等特點(diǎn)而被國(guó)內(nèi)外廣泛應(yīng)用于病蟲害防治， 但不科學(xué)使用仍會(huì)對(duì)生態(tài)環(huán)境和農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)生了一定的負(fù)面影響。隨著農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全法的頒布，以及國(guó)家對(duì)食品安全重視程度越來(lái)越高，果蔬中氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留檢測(cè)就顯得非常重要。目前，蔬菜、水果中氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留檢測(cè)方法主要有氣相色譜法（GC）[3-4]、氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）[5-6]、 高效液相色譜法（HPLC）[7-8]和液相色譜-質(zhì)譜法（LC-MS）[9-10]等，現(xiàn)行行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《NY/T761-2008蔬菜和水果中有機(jī)磷、有機(jī)氯、擬除蟲菊酯和氨基甲酸酯類農(nóng)藥多殘留的測(cè)定》用的即是高效液相色譜法（HPLC）檢測(cè)氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留。

利用高效液相色譜檢測(cè)果蔬、食用菌等農(nóng)產(chǎn)品樣本的原則是要盡可能在較短的時(shí)間內(nèi)使混合物完全分離和定量。對(duì)于多農(nóng)殘的痕量分析還要求有較高的靈敏度，因此最佳的色譜條件對(duì)于待測(cè)組分進(jìn)行定性和定量分析尤為必要。本試驗(yàn)采用高效液相色譜儀對(duì)蔬菜中10種氨基甲酸酯類進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)對(duì)色譜條件進(jìn)行優(yōu)化研究，對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較，得到了比以前報(bào)道和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)更為準(zhǔn)確高效、靈敏度更高的檢測(cè)方法，提高了農(nóng)產(chǎn)品中氨基甲酸酯類農(nóng)藥的檢測(cè)效率。

一、材料和方法

1.供試材料

乙腈、甲醇為色譜級(jí)（美國(guó)天地公司），柱后衍生試劑為pickering公司提供（包含鄰苯二甲醛，OPA，巰基乙醇、OPA稀釋劑和氫氧化鈉溶液），水為超純水，10種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品（涕滅威亞砜、涕滅威砜、滅多威、三羥基克百威、涕滅威、速滅威、克百威、甲萘威、異丙威、仲丁威）購(gòu)自農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所（100μg/mL），純度均大于99%，以乙腈稀釋成合適濃度。供試樣本為包含蔬菜、水果等農(nóng)產(chǎn)品為試驗(yàn)樣本，具體有菜豆，茄子，萵苣，黃瓜，結(jié)球甘藍(lán)，油桃，馬鈴薯，黃果柑，隨機(jī)選擇。

2.儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀（四元泵），配熒光檢測(cè)器（FLD），柱后衍生系統(tǒng)為美國(guó)科學(xué)系統(tǒng)公司的斯威特柱后衍生系統(tǒng)雙通道 PCR-2型，色譜柱為美國(guó)科學(xué)系統(tǒng)公司的Alltima C18 5μm 4.6×250mm 色譜柱。

3.實(shí)驗(yàn)方法

（1）標(biāo)準(zhǔn)液的配制。將以上10種氨基甲酸酯類農(nóng)藥配制成0.005、0.05、0.1、0.2、0.5μg /mL5個(gè)濃度梯度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，為了消除基質(zhì)響應(yīng)，在配制中加入基質(zhì)溶液進(jìn)行配制。

（2）樣品前處理。樣品前處理按《NY/T 761-2008蔬菜和水果中有機(jī)磷、有機(jī)氯、擬除蟲菊酯和氨基甲酸酯類農(nóng)藥多殘留的測(cè)定法》中進(jìn)行操作，在樣本中加入0.05、0.1、0.2、0.5mg/Kg的混合標(biāo)液，每個(gè)樣本7個(gè)平行。

（3）分離條件的選擇。有報(bào)道用乙腈-水、乙腈-乙酸溶液、甲醇-乙酸溶液和甲醇-水作為流動(dòng)相進(jìn)行氨基甲酸酯類的液相檢測(cè)，結(jié)果顯示：乙腈-乙酸銨溶液和甲醇-乙酸銨溶液體系對(duì)10種氨基農(nóng)藥的分離效果和離子化程度都不如乙腈-甲酸溶液。因此，本試驗(yàn)在前人的基礎(chǔ)上提高了流動(dòng)相中有機(jī)相的比例，考查了只用乙腈-水和甲醇-水作為流動(dòng)相，同時(shí)調(diào)整了流動(dòng)相的流速。將配制好的標(biāo)準(zhǔn)品，按從低到高的濃度上機(jī)檢測(cè)，檢測(cè)條件為：FLD激發(fā)波長(zhǎng)λex 330nm，發(fā)射波長(zhǎng)λem 465nm，柱溫為42℃，進(jìn)樣量為20uL，柱后衍生系統(tǒng)NaOH溶液和OPA的流速為0.3mL/min，水解溫度為100℃，衍生溫度為室溫。優(yōu)化后的色譜洗脫程序如表1所示。

（4）樣品測(cè)定。在優(yōu)化色譜條件下，待儀器穩(wěn)定后，重復(fù)進(jìn)樣待相鄰兩針的響應(yīng)值變化小于2.0%時(shí)，按標(biāo)準(zhǔn)溶液-樣品溶液-樣品溶液-標(biāo)準(zhǔn)溶液的順序進(jìn)樣，以標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間定性，以樣品溶液峰面積和標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積比較定量。

二、結(jié)果與分析

1.優(yōu)化后色譜圖

為了獲得最佳分離效果，本試驗(yàn)以乙腈-水和甲醇-水作為流動(dòng)相進(jìn)行試驗(yàn)，最終采用乙腈-水作為流動(dòng)相，優(yōu)化了有機(jī)相的比例和流速，得到的色譜圖如圖1所示，結(jié)果表明，以乙腈-水作流動(dòng)相時(shí)同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液響應(yīng)明顯高于甲醇-水，提高乙腈濃度后，洗脫能力增強(qiáng)，當(dāng)從20%線性增加到90%的過(guò)程中，所有10組分全部被洗脫出來(lái)，分析時(shí)間縮短至17min內(nèi)，相同添加濃度的響應(yīng)也比用甲醇-水作流動(dòng)相高了一倍以上，本試驗(yàn)中采用了等流速，結(jié)果使得基線更為平穩(wěn)。

（a） The chromatograms before optimization the elution conditions ?（b） The chromatograms after optimization the elution conditions

2.檢出限和線性范圍

配制的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液注入高效液相色譜儀，以優(yōu)化后的條件進(jìn)行測(cè)定，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為橫坐標(biāo)、相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，線性回歸得10種氨基甲酸類農(nóng)藥的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限如表2所示，結(jié)果顯示：10種氨基甲酸酯類農(nóng)藥在0.05-0.5mg/Kg范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)除涕滅威亞砜為0.9975外，其它均為1.0，檢出限為0.001-0.007mg/Kg，滿足農(nóng)藥殘留定量分析要求。

3.組分響應(yīng)

以添加濃度為0.1mg/Kg比較以甲醇-水作為流動(dòng)相和以乙腈-水作為流動(dòng)相的保留時(shí)間、峰高以及峰面積，如表3、表4所示。由表3、表4可知，0.1、0.5 mg/Kg兩種添加濃度下，色譜條件優(yōu)化前后，二者的保留時(shí)間具有較大的差異，優(yōu)化后節(jié)約了更多的檢測(cè)時(shí)間，0.1、0.5 mg/Kg添加濃度下仲丁威的出峰時(shí)間縮短最多，提前了4.14min，涕滅威砜的出峰時(shí)間節(jié)約最少，為2.26min，優(yōu)化條件后10組分在17min內(nèi)完全出峰，平均提前了3.54min。且0.1 、0.5 mg/Kg兩種濃度的峰高和峰面積均大于優(yōu)化前，峰高是之前的1.65-4.14倍，峰面積是1.62-3.97倍。

4.精密度

計(jì)算并比較發(fā)現(xiàn)用乙腈-水作為流動(dòng)相，樣本重復(fù)7次所得10種農(nóng)藥各參數(shù)RSD值均低于優(yōu)化前（以樣本加標(biāo)濃度為0.1mg/Kg為例），如表5所示。由表5可知，條件優(yōu)化后，10種氨基甲酸酯類農(nóng)藥檢測(cè)的保留時(shí)間、峰高和峰面積RSD都小于以15：85的甲醇-水作流動(dòng)相的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，（最大相差了1.555），因此可見以乙腈-水作為流動(dòng)相檢測(cè)果蔬中氨基甲酸酯類農(nóng)藥精密度更高。

三、小結(jié)與討論

有文章報(bào)道[13-15]和《NY/T 761-2008》都采用乙腈作為樣品前處理的提取液，能比甲醇、丙酮等更有效的提取該類農(nóng)藥，說(shuō)明該類農(nóng)藥在乙腈中的溶解度更好，因此本研究用乙腈替代甲醇作流動(dòng)相。在《NY/T 761-2008》的基礎(chǔ)上，將流動(dòng)相改為乙腈-水，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，條件優(yōu)化后，對(duì)樣品中10種氨基甲酸酯類農(nóng)藥的洗脫能力得以增強(qiáng)，改善了這10農(nóng)藥的色譜峰形，使得出峰時(shí)間大大提前，節(jié)約了樣品檢測(cè)的時(shí)間;10種農(nóng)藥分離度好，峰面積、峰高響應(yīng)良好，減少了假陽(yáng)性的出現(xiàn)，提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確度，是一種比較理想的檢測(cè)方法，具有較強(qiáng)的可行性和實(shí)用性。在研究中，我們僅用乙腈替代了甲醇，沒(méi)有加入甲酸溶液，也能達(dá)到有效分離的效果，加入的甲酸溶液改變了流動(dòng)相的pH值，對(duì)儀器有一定的污染，因此，我們用乙腈-水作為本試驗(yàn)的流動(dòng)相，即能有效分離，不污染儀器，又經(jīng)濟(jì)節(jié)約。

參考文獻(xiàn)：

[1] 龔久平，李燕，洪云菊等. 高效液相色譜法測(cè)定蔬菜中氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留方法優(yōu)化[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2009，05：1332-1335.

[2]中華人民共和國(guó)農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全法[S].中華人民共和國(guó)， 2006.

[3] 戴廷燦，倪永年，盧普濱等.我國(guó)農(nóng)藥殘留檢測(cè)技術(shù)現(xiàn)狀[J].農(nóng)藥， 2004， 09： 389-393.

[4] 龔久平，康月瓊，張宗美. 蔬菜中有機(jī)磷和氨基甲酸醋類農(nóng)藥多種殘留的測(cè)定 [J]. 西南園藝， 2004 ， 32（ 5）： 27- 33.

[5]王俊、管有志、于微等，GC-MS法高靈敏檢測(cè)蔬菜中氨基甲酸酯農(nóng)藥殘留[J]，中國(guó)熱帶醫(yī)學(xué)，2013，02.

[6]易盛國(guó)，張義蓉，韓梅等，蔬菜中有機(jī)磷和氨基甲酸酯農(nóng)藥殘留GC-MS-SIM分析[J]化學(xué)研究與應(yīng)用，2005，01.

[7] 董曉尉. 竹筍中氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留量的高效液相色譜分析[D].浙江工業(yè)大學(xué)，2013.

[8] 張靜， 閆實(shí)， 王蕾等. HPLC測(cè)定蔬菜、 水果中氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留量[J]. 沈陽(yáng)化工學(xué)院學(xué)報(bào)， 2007 ， 21（ 2）： 157- 160 .

[9] 龔韋，劉惠民，石杰等.LC-MS-MS分析煙草中氨基甲酸酯農(nóng)藥殘留[J]. 煙草科技，2008，08.

[10] 陳曉紅，李小平，金米聰. 蔬菜中氨基甲酸醋類農(nóng)藥殘留的HPLC /MS測(cè)定研究 [ J]. 中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志， 2006 ， 16（ 9）： 1041- 1043 .

[11] NY/T 761-2008 蔬菜和水果中有機(jī)磷、有機(jī)氯、擬除蟲菊酯和氨基甲酸酯類農(nóng)藥多殘留的測(cè)定[S].中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部，2008.

[12] 羅惠明，陳燕勤，梁希揚(yáng)等. 蔬菜、水果中氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留量液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜檢驗(yàn)方法[J]. 檢驗(yàn)檢疫科學(xué)，2008，05：26-29.

[13] 熊英，楊俊英，康月瓊等. 蔬菜中 13種有機(jī)磷農(nóng)藥殘留量的雙柱法氣相色譜測(cè)定[ J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2009 ， 22（ 2）： 528-531

[14] 孫俊，董梁，張梅霞等. 農(nóng)藥殘留檢測(cè)方法及光譜技術(shù)在生菜農(nóng)殘檢測(cè)中的應(yīng)用[J]. 農(nóng)機(jī)化研究，2014，09：209-212.

[15] 張輝. 液相色譜法檢測(cè)糧油農(nóng)殘的研究進(jìn)展[J]. 食品業(yè)，2014，04：201-203.