劉艷偉 孟愛霞 胡 華 李連泰 杜志峰 王書君 徐 昆

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院骨傷科，承德067000)

膝骨關(guān)節(jié)炎(Knee osteoarthritis,KOA)是最常見的關(guān)節(jié)退行性疾病，我國成年人中膝骨關(guān)節(jié)炎的患病率高達(dá)9.6%。隨著社會人口老齡化，本病的發(fā)生率也將越來越高[1]。由于關(guān)節(jié)軟骨損傷后很難修復(fù)，嚴(yán)重影響關(guān)節(jié)功能的恢復(fù)，導(dǎo)致治療周期長，給患者的生活帶來嚴(yán)重影響。因此，如何修復(fù)損傷的關(guān)節(jié)軟骨，恢復(fù)關(guān)節(jié)功能，成為臨床康復(fù)醫(yī)學(xué)棘手的問題。研究顯示，MMP-3、TGF-β1和TNF-α在關(guān)節(jié)軟骨損傷及修復(fù)過程中發(fā)揮著重要作用[2，3]。MMP-3是MMPs家族的主要成員之一，能分泌大量的細(xì)胞外分子，降解細(xì)胞外基質(zhì)膜成分，參與膝骨關(guān)節(jié)炎病程發(fā)展的重要物質(zhì)[4]。TNF-α是一種血管生成多肽因子，與軟骨組織的破壞關(guān)系密切。TGF-β1屬于轉(zhuǎn)化生長因子，膝骨關(guān)節(jié)炎患者常表現(xiàn)出高表達(dá)，同時也是病情加重的重要促進(jìn)因素[5]。KOA的臨床治療主要是改善相關(guān)癥狀，非甾體抗炎藥是常用藥物，但長期服用常引起副作用，如胃腸道不適等。臨床研究表明：針灸在緩解患者膝關(guān)節(jié)炎引起的疼痛、腫脹等方面有顯著療效，但具體機(jī)制尚不明確[6，7]?；疳樑R床治療膝骨關(guān)節(jié)炎療效顯著，具有舒筋通絡(luò)、止痛、消腫的功效。本研究旨在探討火針對KOA大鼠關(guān)節(jié)軟骨MMP-3、TGF-β1、TNF-α的影響。

1 材料與方法

1.1材料 30只6周齡雄性SPF級SD大鼠,體質(zhì)量(250±20)g,河北省醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供,實驗動物許可證號：SCXK(冀)2014-001。實驗過程中對大鼠的處置嚴(yán)格遵守國家科技部發(fā)布的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》。轉(zhuǎn)化生長因子β1放免試劑盒、腫瘤壞死因子α放免試劑盒、基質(zhì)金屬蛋白酶3放免試劑盒(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；石膏繃帶(浙江義烏諾醫(yī)療衛(wèi)生用品有限公司)；火針(北京中國針灸研究所)。lympus光學(xué)顯微鏡(日本BHS)；Neofuge 15R臺式高速冷凍離心機(jī)(Heal Force)；DV800型全自動生化測定儀(美國Bechman公司)。

1.2方法

1.2.1分組 將30只大鼠隨機(jī)分為正常組10只，模型組20只。參考文獻(xiàn)[2]方法，模型組采用后肢伸直位固定法造模。造模前12 h禁食，麻醉后剃去后肢髖關(guān)節(jié)至腳趾毛，踝關(guān)節(jié)背屈70～90度，伸展膝關(guān)節(jié)至160～180度，紗布固定，將石膏從腹股溝至腳趾纏繞大鼠后肢，腳趾露出，繃帶固定。每日2次觀察制動情況及其腳趾血流情況，6周后解除束縛，觀察大鼠行為學(xué)改變，后肢膝關(guān)節(jié)腫脹情況，對局部按壓的疼痛反應(yīng)程度等各方面進(jìn)行程度評分。將20只KOA模型大鼠隨機(jī)再分為模型組、火針組。正常組和模型組給予正常飲食，不作任何治療?；疳樈M參照《實驗針灸學(xué)》，選取膝前穴、阿是穴和陽陵泉穴，在穴位上涂一層薄薄的萬花油，在酒精燈的外焰將賀氏火針燒至紅白，迅速點(diǎn)刺入1～2 mm，然后迅速拔出，干棉球按壓針孔片刻，每3 d行一次針，共治療6次。

1.2.2Lequesne MG評分 造模結(jié)束后及最后一次火針后的次日即對全部大鼠進(jìn)行評分，觀察其后肢膝關(guān)節(jié)腫脹情況，局部按壓疼痛反應(yīng)、步態(tài)、關(guān)節(jié)可自由活動的角度等方面由同一觀察者進(jìn)行操作評分。

1.2.3標(biāo)本采集 脫頸處死各組大鼠，收集腹主動脈血，固定大鼠，伸直關(guān)節(jié)，切開皮膚，取下整個膝關(guān)節(jié)，觀察軟骨平面狀況，0.9%生理鹽水沖洗，然后一份置于4%中性甲醛中，另一份液氮凍存后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存，備用。

1.2.4血清MMP-3、TGF-β1和TNF-α檢測 取出-80℃冰箱血清樣品，按照試劑盒操作步驟，采用全自動生化檢測儀酶聯(lián)免疫法測定各組大鼠血清中MMP-3、TGF-β1和TNF-α水平。

1.2.5大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織HE染色觀察 大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織置于4%甲醛溶液中固定24 h，70%、80%、90%和100%梯度乙醇脫水，石蠟包埋，切片，二甲苯透化，脫蠟，蒸餾水沖洗，進(jìn)行HE染色，利用倒置顯微鏡觀察膝關(guān)節(jié)軟骨病理組織形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.2.6放射免疫檢測軟骨組織中MMP-3、TGF-β1和TNF-α 取-80℃冰箱保存的大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織，稱重后加入9倍量0.9%生理鹽水，勻漿，4℃下3 000 r/min離心15 min，取上清液，按照放免試劑盒操作步驟進(jìn)行放射免疫檢測，測定各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨中MMP-3、TGF-β1和TNF-α水平。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠Lequesne MG評分 治療前，與正常組比較，模型組和火針組大鼠Lequesne MG評分差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；治療后，與模型組和治療前比較，火針組大鼠評分明顯較低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。表明火針治療可明顯有效緩解KOA大鼠癥狀，對膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠的行為學(xué)狀態(tài)具有明顯的改善作用。

2.2各組大鼠血清MMP-3、TGF-β1和TNF-α表達(dá)水平 與正常組比較，模型組大鼠血清MMP-3、TGF-β1和TNF-α表達(dá)水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，火針組大鼠血清MMP-3、TGF-β1和TNF-α表達(dá)水平均明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

2.3各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織HE染色形態(tài) 顯微鏡下顯示：正常組大鼠膝骨關(guān)節(jié)軟骨表面光滑，細(xì)胞排列有一定規(guī)則，潮線清晰可見；模型組大鼠膝骨關(guān)節(jié)軟骨表面粗糙，軟骨細(xì)胞肥大，表層細(xì)胞壞死，巢狀增生，潮線消失，呈現(xiàn)明顯退行性病變；火針組大鼠膝骨關(guān)節(jié)軟骨表面較光滑，細(xì)胞排列規(guī)則，表層細(xì)胞輕度增生，潮線較完整。見圖3。

GroupsnBefore treatmentAfter treatmentControl1000Model108.41±0.861)7.18±0.671)Heated needle108.38±0.911)3.52±0.542)

Note：Compared with control group,1)P<0.05；compared with model group,2)P<0.05.

GroupsnMMP-3TGF-β1TNF-αControl1019.98±1.2415.11±1.0221.75±0.67Model1040.01±2.731)31.78±2.551)66.86±1.001)Heated needle1026.45±2.912)20.01±1.922)25.82±0.532)

Note：Compared with control group,1)P<0.05；compared with model group,2)P<0.05.

2.4放射免疫檢測各組大鼠軟骨組織中MMP-3、TGF-β1和TNF-α 與正常組比較，模型組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中MMP-3、TGF-β1和TNF-α含量均顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，火針組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織MMP-3、TGF-β1和TNF-α含量均明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表3。表明火針治療能通過降低過度表達(dá)的MMP-3、TGF-β1和TNF-α使其發(fā)揮對膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的促修復(fù)作用。

3 討論

KOA是一種以軟骨進(jìn)行性關(guān)節(jié)軟骨變性、破壞，伴隨骨質(zhì)增生反應(yīng)的退行性疾病，以膝關(guān)節(jié)疼、腫脹、活動障礙為主要臨床表現(xiàn)，是臨床最常見的關(guān)節(jié)疾病之一，近年來發(fā)病率呈逐年上升趨勢[8]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，軟骨合成降解因子水平降低、促合成因子水平增高是引起KOA的重要原因，而炎癥因子水平紊亂是該病發(fā)展的重要推動因素[9]。KOA屬于傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)“骨痹”、“痹證”、“膝痹”等范疇，多因風(fēng)寒之邪引起，患者常表現(xiàn)出下肢畏寒、得溫痛減等癥狀[10，11]。針刺是中醫(yī)治療的重要組成部分，是臨床治療膝骨關(guān)節(jié)炎的常用手段，具有疏通經(jīng)絡(luò)氣血、消腫止痛之功，廣泛用于KOA的治療，臨床療效顯著?；疳樖轻樉牡囊环N，可溫經(jīng)散寒、消腫止痛、通經(jīng)活絡(luò)、巧腐生新，能夠有效改善KOA癥狀。陽陵泉穴為八會穴之筋會，為治療筋病的要穴，具有強(qiáng)健腰膝、壯筋補(bǔ)虛功能；膝前及阿是穴能疏通局部經(jīng)氣、行氣活血祛瘀。林國華等[12]發(fā)現(xiàn)“膝前穴、阿是穴、陽陵泉穴”三穴行使火針能抑制小鼠KOA病變發(fā)展，明顯改善膝關(guān)節(jié)靈活性。但目前火針對膝骨關(guān)節(jié)炎的治療作用相關(guān)機(jī)制少見報道，本研究選取膝前穴、阿是穴和陽陵泉穴火針治療6次后發(fā)現(xiàn)KOA模型大鼠膝骨關(guān)節(jié)軟骨表面較光滑，細(xì)胞排列規(guī)則，表層細(xì)胞輕度增生，潮線較完整，表明火針可改善KOA大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞排列情況，進(jìn)而改善軟骨表面光滑度，達(dá)到治療目的，為火針的臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

圖1 各組大鼠膝骨關(guān)節(jié)軟骨組織HE染色(×100)

GroupsnMMP-3(μg/mg)TGF-β1(pg/mg)TNF-α(pg/mg)Control109.11±0.121.44±0.136.79±0.88Model1021.48±0.391)3.37±0.221)12.03±1.011)Heated needle1012.61±0.222)2.10±0.192)8.23±0.732)

Note：Compared with control group,1)P<0.05；compared with model group,2)P<0.05.

MMP-3是MMPs家族的主要成員之一，在膝骨關(guān)節(jié)炎、心血管疾病等疾病過程中起到重要促進(jìn)作用，MMP-3是直接作用于膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白分解酶，導(dǎo)致其細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)降解，加速軟骨代謝分解，加重膝關(guān)節(jié)軟骨組織進(jìn)一步損傷[13]。TGF-β1屬于轉(zhuǎn)化生長因子，與骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，同時也是病情加重的重要促進(jìn)因素。TGF-β1具有多種生物學(xué)作用：①促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)降解；②趨化單核細(xì)胞和成纖維細(xì)胞；③促進(jìn)成骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞生長[14]。TNF-α是一種血管生成多肽因子，一方面其對軟骨細(xì)胞有極強(qiáng)的分解破壞作用，另一方面還可抑制軟骨基質(zhì)合成。研究顯示，TNF-α可誘導(dǎo)產(chǎn)生前列腺素E2，前列腺素E2不僅可以直接對軟骨下骨產(chǎn)生分解，而且可以誘導(dǎo)激活MMPs，對軟骨基質(zhì)的纖維結(jié)構(gòu)重建造成嚴(yán)重阻礙作用[15-17]。本研究結(jié)果顯示，KOA模型大鼠血清和軟骨組織中MMP-3、TGF-β1和TNF-α表達(dá)水平均顯著升高，表明造模引發(fā)大鼠膝關(guān)節(jié)局部無菌性炎癥，誘發(fā)TNF-α大量表達(dá)，激活基質(zhì)金屬蛋白酶原，導(dǎo)致MMP-3、TGF-β1含量升高。經(jīng)火針治療后，KOA大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨中MMP-3、TGF-β1和TNF-α明顯低于模型組，表明火針干預(yù)治療可抑制破壞因子的表達(dá)。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示火針治療可有效減輕大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨損傷，降低血清及膝關(guān)節(jié)軟骨組織中MMP-3、TGF-β1和TNF-α水平，這可能是火針治療膝骨關(guān)節(jié)炎的一個作用機(jī)制。