張娟 殷博凱 郭艷芹 何治

翻譯后蛋白修飾可以動態(tài)地重新規(guī)劃細胞蛋白的特性和功能，以應(yīng)對機體內(nèi)環(huán)境失衡，泛素化就是其中一種[1]。泛素可以影響蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性、定位、相互作用力和功能，在生理條件下泛素化對大部分真核細胞至關(guān)重要，并且在氧化應(yīng)激、基因毒性、熱應(yīng)激等應(yīng)激條件下其重要性更加突顯[1]。研究表明，局灶性腦缺血和全腦缺血后，泛素化底物蛋白水平升高[2]。腦缺血后泛素化水平的升高是一個尚未被充分研究的領(lǐng)域，更好地理解泛素化有助于開發(fā)新的卒中治療方法。筆者旨在對泛素化的研究進展、泛素化與應(yīng)激的關(guān)系、泛素化與神經(jīng)細胞的關(guān)系、泛素化與腦缺血-再灌注損傷的關(guān)系、腦缺血-再灌注損傷誘導(dǎo)的泛素化類型及腦缺血后泛素化升高的潛在因素進行綜述。

1 泛素化

1.1 泛素化過程

在真核細胞中，泛素化是泛素(一類低分子量的蛋白質(zhì))分子以泛素單體或泛素鏈形式與底物蛋白共價結(jié)合時發(fā)生的一種高度通用的翻譯后蛋白修飾過程[1]。泛素具有7個賴氨酸位點(K6、K11、K27、K29、K33、K48和K63)和位于N端的甲硫氨酸位點，易發(fā)生自泛素化進而延伸形成不同類型的多聚泛素鏈[3]。泛素分子與底物的結(jié)合需要活化酶、偶聯(lián)酶和連接酶的連續(xù)作用，在第1步中，活化酶水解三磷酸腺苷將1個泛素分子腺苷?；ㄟ^活化中心的半胱氨酸殘基與泛素C端甘氨酸形成硫酯鍵來活化泛素，之后泛素依次轉(zhuǎn)移到偶聯(lián)酶和連接酶，連接酶進而招募特定底物蛋白并使賴氨酸殘基的氨基與泛素分子的C端羧基形成異肽鍵，從而完成泛素化修飾[4]。底物蛋白被蛋白酶體識別前，必須被標記至少4個泛素分子(以多聚泛素鏈形式存在)[3]。

1.2 泛素化的復(fù)雜性

泛素顯著影響蛋白質(zhì)功能，一方面源于結(jié)合系統(tǒng)的復(fù)雜性，另一方面源于泛素形成不同拓撲結(jié)構(gòu)聚合物的能力[5]。雖然哺乳動物細胞中只有2種活化酶，但約有40種偶聯(lián)酶和600種連接酶，它們有可能以一種混合搭配的方式協(xié)同工作產(chǎn)生約25 000種不同的結(jié)合對，特異地驅(qū)動底物蛋白，還有100多種去泛素酶也可以從底物中去除泛素[6]。除了結(jié)合系統(tǒng)的多樣性，泛素化的復(fù)雜還因其具有8個結(jié)合位點，形成至少8個不同的聯(lián)系[3]。雖然不常見，但也能觀察到混合鏈，即在1個泛素分子中同時有2種及以上賴氨酸位點進行鏈接[7]。泛素還可以作為單體附著在底物蛋白中的1個或多個目標位點上[7]。不同的泛素鏈具有不同的功能，因此泛素化蛋白的命運嚴重依賴于相關(guān)泛素的結(jié)構(gòu)。除少數(shù)情況外，K48鏈作為降解信號，K11和K29鏈也作為蛋白酶體識別進行降解的信號[8]。相反，泛素單體、K63鏈及甲硫氨酸鏈是完全不可降解的信號[9]。這是由于K11、K29和K48聚合物的三維形狀與甲硫氨酸鏈、K63鏈及泛素單體不同[9]。因此，單體分子泛素化與通過不同鏈的泛素化具有完全不同的修飾，它們以不同的方式?jīng)Q定蛋白質(zhì)的命運。

1.3 泛素化的重要性

在任一特定的時間，細胞中有超過5 000種蛋白質(zhì)被泛素化，約占人類編碼蛋白質(zhì)的1/4[10]。因此，泛素化對細胞穩(wěn)態(tài)的影響巨大。20世紀80年代初泛素化被發(fā)現(xiàn)初期，僅被作為蛋白降解信號。隨著研究的深入，逐漸認識到泛素化與細胞眾多過程密切相關(guān)，包括細胞周期控制、酶激活、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄和DNA修復(fù)、受體轉(zhuǎn)運、免疫反應(yīng)、炎性反應(yīng)和凋亡等[5]。

2 泛素化與應(yīng)激

除了控制重要的生理功能外，泛素系統(tǒng)在細胞應(yīng)激反應(yīng)中也起著重要的作用。泛素偶聯(lián)物的增加可發(fā)生在所有類型的應(yīng)激過程中，如熱休克、氧化劑、重金屬、DNA損傷劑等。哺乳動物細胞，包括神經(jīng)細胞，在應(yīng)激的誘導(dǎo)下增加了泛素數(shù)量[11]。此外，泛素活化酶、偶聯(lián)酶和連接酶的活性和表達也隨著應(yīng)激反應(yīng)而升高[11]。泛素對細胞的保護是通過降解和非降解機制介導(dǎo)的，如被K48泛素修飾的蛋白質(zhì)會被26S蛋白酶體識別并降解[9]。另外，雖然非降解泛素鏈在應(yīng)激反應(yīng)中的作用尚未被廣泛研究，但是K63泛素的缺失降低了細胞對氧化應(yīng)激的抵抗[12]。由于氧化應(yīng)激是缺血過程的一個組成部分，因此在缺血的神經(jīng)細胞中泛素對氧化應(yīng)激的調(diào)節(jié)十分重要。

3 泛素化與神經(jīng)細胞的關(guān)系

4 泛素化與腦缺血-再灌注損傷的關(guān)系

腦缺血帶給受影響的大腦區(qū)域細胞巨大壓力，而腦細胞對這種壓力的反應(yīng)之一就是泛素化的增加。1991年Hayashi等[18]首次發(fā)現(xiàn)腦缺血會升高大鼠海馬區(qū)域泛素免疫反應(yīng)活性，并出現(xiàn)大量泛素化相關(guān)蛋白。Hayashi等[19]后續(xù)報道了沙鼠皮質(zhì)和海馬局部缺血-再灌注早期泛素化增加，30～60 min達到峰值，12～24 h趨于消退。在大鼠和小鼠局灶性腦缺血2種模型中，泛素化需要再灌注，這是由于在再灌注前，缺血組織中對泛素結(jié)合至關(guān)重要的三磷酸腺苷供應(yīng)受到限制。另外，再灌注為泛素化提供誘導(dǎo)信號，如通過產(chǎn)生自由基或激活與興奮毒性等相關(guān)的信號級聯(lián)[19-20]。大鼠純?nèi)毖鯎p傷在缺氧后恢復(fù)期并未增加泛素化，這表明血流量的缺乏和重建可能對泛素化的激活至關(guān)重要[21-22]。然而，需要更多的研究來證實這一點，因為其中一項研究采用的是輕度缺氧(15%的氧氣濃度)，機體的代償系統(tǒng)可能會緩解缺氧帶來的壓力[21]；另一項研究是在未成熟的大腦中進行，未成熟大腦某些神經(jīng)傳遞系統(tǒng)發(fā)育不成熟或相關(guān)酶供應(yīng)不足，不能有效地引起泛素化的增加[22]。

目前動物實驗表明，缺血后泛素化可通過再灌注立即誘導(dǎo)，并在梗死周圍具有生存潛能的神經(jīng)細胞中檢測到[20]。在全腦缺血模型中，易受缺血應(yīng)激影響的海馬CA1區(qū)和皮質(zhì)泛素化程度增加[23]。在損傷后恢復(fù)正常形態(tài)的神經(jīng)細胞中，泛素化的升高是短暫的，而在死亡的神經(jīng)細胞中泛素化水平很高[23]。在腦缺血大鼠中，低溫可保存缺血后海馬CA1區(qū)泛素免疫反應(yīng)活性，減少缺血后泛素化的啟動[24]。雖然經(jīng)過治療的腦缺血大鼠海馬CA1區(qū)泛素化水平降低[25]，但是泛素化的升高可能不是神經(jīng)細胞死亡的原因，而是防止這些神經(jīng)細胞立即死亡的補償性保護機制的一部分[26]。某些缺血模型中泛素化的減少可能是由于缺血程度輕致神經(jīng)細胞壓力較小[27]。泛素化在再灌注開始后、任何細胞死亡發(fā)生之前，以及在未造成任何損害的損傷后，均可立即和短暫地升高[22]，并且泛素化水平會隨著缺血時間的延長而增加，這可能只是反映了更高的應(yīng)激水平[27]。

5 腦缺血-再灌注損傷誘導(dǎo)的泛素化類型

為了預(yù)測泛素化對靶蛋白的影響，有必要評估相關(guān)泛素類型。質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)，全腦缺血模型中普遍存在的泛素鏈包括K6、K11、K48、K63鏈[28]。局灶性缺血模型中，用賴氨酸特異性抗體檢測到K48和K63鏈[29]?？山到夂筒豢山到夥核劓湹拇嬖诒砻鳎鞍酌阁w介導(dǎo)的降解作用減少不是缺血后泛素化水平升高的唯一原因。在Psmc1基因敲除抑制26蛋白酶體表達的小鼠中，局灶性腦缺血后不能誘導(dǎo)代表不可降解信號的K63泛素鏈[18]，提示缺血后泛素化水平升高存在其他機制。

6 腦缺血-再灌注損傷后泛素化升高的潛在因素

對大鼠短暫性腦缺血前后泛素基因的差異表達進行分析顯示，相關(guān)基因表達的增加發(fā)生得太晚，無法解釋缺血后泛素化的增加，也證實泛素化的升高不是由于泛素化相關(guān)底物蛋白的增加[30]，因為底物蛋白的增加必然伴隨著自由泛素的耗損[20]。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，泛素化水平的增加涉及多方面因素。

6.1 泛素結(jié)合機制成分變化

Hsc70羧基末端反應(yīng)蛋白是一種泛素連接酶，在應(yīng)激過程中控制伴侶蛋白的活性和水平。其在體外海馬切片中的過表達，可防止氧糖剝奪誘導(dǎo)的神經(jīng)細胞死亡[31]。然而，神經(jīng)前體細胞表達發(fā)育抑制蛋白4 (neuralprecursor cell-expressed developmentally down-regulated 4，Nedd4)作為一種泛素連接酶在神經(jīng)細胞局部缺血時表達增加，提示它們與神經(jīng)保護有關(guān)[32]。Nedd4適配器蛋白(Nedd4 family interacting protein 1，Ndfip1)可在卒中過程中發(fā)揮保護作用，因為Ndfip1敲除小鼠表現(xiàn)出更大的梗死體積[33]。腦缺血后蛋白水平改變的另一泛素連接酶是帕金蛋白。成神經(jīng)細胞瘤細胞的氧糖剝奪及小鼠局灶性缺血均能降低帕金蛋白水平，導(dǎo)致線粒體破碎和潛在的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[34]。與其他泛素連接酶一樣，帕金蛋白也具有神經(jīng)保護作用。綜上所述，缺血后泛素水平的升高可能是泛素結(jié)合機制成分變化所致。

6.2 泛素去結(jié)合機制成分變化

泛素羧基末端水解酶L1(ubiquitin carboxy terminal hydrolases L1，UCH-L1)是一種在神經(jīng)細胞中高表達的去泛素酶，其在帕金森病和阿爾茨海默病中的保護作用引起了人們的關(guān)注[35]。與神經(jīng)退行性變性疾病類似，UCH-L1過表達可保護神經(jīng)細胞免受缺氧損傷[36]，而成神經(jīng)細胞瘤細胞中UCH-L1活性下調(diào)可增加氧糖剝奪誘導(dǎo)的細胞死亡[37]。UCH-L1被缺氧藥物抑制24 h后，會增加原代神經(jīng)細胞的泛素化蛋白表達[36]。另一個可能在卒中和神經(jīng)退行性變性疾病中起作用的去泛素酶是泛素特異性蛋白酶14(ubiquitin specific protease14，USP14)，它通過修飾K48鏈調(diào)控泛素化蛋白的蛋白酶體降解[38]。抑制USP14能增強蛋白酶體活性促進Tau蛋白降解，在阿爾茨海默病細胞模型中具有保護作用[39]。注射特定的USP14抑制劑可減輕局灶性缺血小鼠神經(jīng)細胞損傷，這種保護作用可能與缺血24 h后檢測到的蛋白酶體活性增強和泛素化蛋白減少有關(guān)[40]。目前不清楚泛素化蛋白的減少是否具有神經(jīng)保護作用，或者只是在這個時間點上減少損傷的一種措施。需要更多的研究來觀察早期的再灌注時間，以便在缺血后將USP14與泛素化連接起來。

6.3 泛素化結(jié)合物清除減少

6.3.1蛋白酶體：蛋白酶體是一種有多種蛋白水解酶活性的多亞基復(fù)合物，具有泛素依賴性。泛素化增加可能是由于蛋白酶體對泛素化相關(guān)蛋白降解減少而引起，經(jīng)典的26S蛋白酶體活性在缺血和再灌注期間明顯降低[20,40]，如通過預(yù)處理維持缺血后蛋白酶體活性的大鼠，可以減少短暫全腦缺血后的蛋白質(zhì)泛素化[41]。但是轉(zhuǎn)基因過表達一種增強蛋白酶體降解的蛋白酶體適配器蛋白后，小鼠泛素化水平卻降低[42]。因此，蛋白酶體抑制和泛素化之間的因果關(guān)系尚未確定，腦缺血后泛素化蛋白的富集是否為蛋白酶體損傷的直接結(jié)果有待進一步研究。

蛋白酶體抑制劑可在各種卒中模型中提供神經(jīng)保護，如缺血后靜脈、腹腔和產(chǎn)前注射蛋白酶體抑制劑MLN519、硼替佐米、CVT-634和BSc2118可導(dǎo)致神經(jīng)保護[43]。但這些研究均未證實蛋白酶體抑制劑對腦蛋白酶體活性的抑制作用，而且不清楚這些抑制劑能否跨越血-腦屏障。這些抑制劑可能通過一種腦獨立的機制減輕缺血后的神經(jīng)炎性反應(yīng)和血-腦屏障的破壞來發(fā)揮作用[44]。因此，無法肯定蛋白酶體抑制劑發(fā)揮神經(jīng)保護作用的途徑。

6.3.2自噬：除蛋白酶體外，泛素化相關(guān)蛋白的清除也可以通過自噬來完成，自噬主要負責(zé)回收細胞器和大的細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)，也可以消化更大的泛素化聚集體。缺血后自噬調(diào)控研究較少，關(guān)于腦缺血后自噬是受損還是激活的報道相互矛盾。一項研究表明，在體內(nèi)和體外缺血后的再灌注過程中，自噬持續(xù)上調(diào)，再灌注過程中阻斷自噬會增加梗死體積和細胞死亡[45]。相反，在另一項動物實驗中，缺血后的自噬通量下降，尤其是在死亡神經(jīng)細胞中[46]。因此，不能確定這是否與泛素化蛋白的早期增加有關(guān)。

缺血后蛋白泛素化在缺血區(qū)邊緣神經(jīng)細胞中迅速、短暫增加，且這種增加依賴于再灌注。鑒于泛素化對細胞穩(wěn)態(tài)和應(yīng)激反應(yīng)的重要性，這種變化對神經(jīng)細胞存活和功能的影響顯著。針對癌癥和神經(jīng)退行性變性疾病的泛素化系統(tǒng)的治療已有先例，此類干預(yù)措施也可能適用于卒中。然而，目前對腦缺血后泛素化是如何誘導(dǎo)、泛素化涉及的酶，以及泛素化對神經(jīng)細胞和最終卒中結(jié)局的影響知之甚少。在探索調(diào)節(jié)泛素化以達到治療目的前，有必要更好地了解泛素在缺血性卒中中的作用。