李 蓉，姚國敏，王小娣，姚 楊

作者單位:(710077)中國陜西省西安市，西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院1眼科;2中心實(shí)驗(yàn)室

0 引言

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病(diabetes mellitus，DM)最嚴(yán)重且最常見的并發(fā)癥之一［1］。在DM的進(jìn)展過程中，高血糖導(dǎo)致慢性微血管損傷，使得約1/10的患者出現(xiàn)增生性DR(proliferative DR，PDR)或糖尿病性黃斑水腫，嚴(yán)重威脅患者視力［2］。隨著生活水平的提升，DM的發(fā)病率逐年攀升［3］，但針對DR目前仍缺乏有效的治療方法或藥物。根據(jù)病程發(fā)展的不同階段，DR分為早期的非增生性DR(non－proliferative DR，NPDR)和晚期的PDR［4］。PDR的標(biāo)志就是形成視網(wǎng)膜新生血管，其血管結(jié)構(gòu)非常脆弱且易滲漏，最終導(dǎo)致不可逆的視網(wǎng)膜損傷和盲目［2，5］。因此，抑制血管生成就成為了近年來具有前景的DR治療策略［6］。

脂聯(lián)素(adiponectin，APN)是由脂肪細(xì)胞分泌的一種內(nèi)源性生物活性蛋白質(zhì)。臨床發(fā)現(xiàn)血清APN濃度降低與肥胖和2型DM的發(fā)生有關(guān)，APN通過直接代謝和胰島素增敏作用在各種組織中發(fā)揮有益的抗DM作用［7－9］。在缺血性視網(wǎng)膜病變的動物模型中發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)APN可明顯減少缺氧誘導(dǎo)的病理性視網(wǎng)膜新生血管，認(rèn)為APN是視網(wǎng)膜病理性微血管形成的負(fù)向調(diào)控者，對視網(wǎng)膜血管損傷起著保護(hù)作用［10］。然而，目前對于血清APN 水平與 DR 的關(guān)系尚無定論［11－13］，APN 對高糖誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜新生血管形成的作用也不清楚。鑒于此，本研究利用高糖刺激條件下的RF/6A細(xì)胞觀察APN對其增殖、遷移及管腔形成過程的影響，為明確APN對DR的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料 恒河猴脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞(RF/6A細(xì)胞)購自武漢普諾賽生命科技有限公司;1640培養(yǎng)基、0.25%胰酶均購自美國Gibco公司;胎牛血清購自美國Invitrogen公司;青霉素、鏈霉素購自美國Hyclong公司;APN購自金斯瑞生生物科技有限公司;CCK－8細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司;Transwell小室、Matrigel基質(zhì)膠均購自美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 將 RF/6A細(xì)胞置于1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和 100μg/mL鏈霉素)中，在37℃、5%CO2及飽和濕度條件下常規(guī)培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞的密度達(dá)到80%時，用0.25%胰酶消化細(xì)胞，終止消化后收集細(xì)胞，用PBS將細(xì)胞潤洗2次，1200r/min，離心3min，加入培養(yǎng)基吹打細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，按1∶3的比例傳代，37℃、5%CO2及飽和濕度條件下擴(kuò)大培養(yǎng)。將RF/6A細(xì)胞分為空白對照組、甘露醇對照組、高糖組、高糖+APN組。處理方法:空白對照組細(xì)胞采用正常培養(yǎng)基培養(yǎng);甘露醇對照組細(xì)胞采用含20mmol/L甘露醇的培養(yǎng)基培養(yǎng);高糖組細(xì)胞采用含25mmol/L D－葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng);高糖+APN組細(xì)胞采用含25mmol/L D－葡萄糖+10μg/mL APN的培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2.2 CCK－8法檢測細(xì)胞活性 將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞消化后，配制成 5×104個/mL的單細(xì)胞懸液，每孔100μL，將細(xì)胞均勻接種至96孔板中，同時設(shè)置空白孔，周圍孔加入100μL PBS，37℃、5%CO2飽和濕度條件過夜培養(yǎng)。按照分組條件處理48h后，向每孔加入 10μL CCK－8溶液，37℃ 培養(yǎng) 4h，振蕩 10min，用酶標(biāo)儀(美國Thermo scientific，MK3型)測定各孔在450nm處的吸光值(A)。細(xì)胞增殖率(%)=(A實(shí)驗(yàn)組－A空白孔)/(A空白對照組－A空白孔)×100%。

1.2.3 Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移 取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，0.25%胰酶消化后，用1640培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后按照每孔5×105/個細(xì)胞均勻接種至6孔板中，37℃、5%CO2飽和濕度條件過夜培養(yǎng)。按照分組條件處理48h，0.25%胰酶消化收集，1 200r/m，離心3min，去上清，PBS潤洗2次，清洗掉殘余血清。無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，用無血清培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞濃度至2×105/mL，備用。在24孔板中加入800μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，并放入Transwell小室，在Transwell上室分別接入200μL各組細(xì)胞懸液，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h;取出Transwell用PBS清洗小室，用70%冰乙醇溶液固定細(xì)胞1h;用0.5%結(jié)晶紫染液染色，室溫中放置20min，PBS清洗后用干凈的棉球?qū)⑸鲜乙粋?cè)的未遷移的細(xì)胞擦干凈，顯微鏡下觀察拍照，每個小室隨機(jī)選取5個視野，計(jì)數(shù)遷移的細(xì)胞。

1.2.4 Matrigel膠實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞管腔形成 于4℃過夜融化Matrigel膠，預(yù)冷24孔板和槍頭，每孔200μL基質(zhì)膠加至24孔板，低速無菌離心除去氣泡，37℃孵育40min，取上述不同分組處理48h后的細(xì)胞，0.25%胰酶消化后，用無血清培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后按照每孔2×105/個將細(xì)胞均勻接種至預(yù)鋪有基質(zhì)膠的24孔板中，37℃、5%CO2飽和濕度條件過夜培養(yǎng)后在顯微鏡下拍照。隨機(jī)取3個視野(×100)照相，采用Image J圖像分析軟件計(jì)算完整管腔數(shù)(每3個分叉處記作1個血管腔)，取平均值。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:本研究采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(珋x±s)表示，組間差異采取方差分析和LSD－t檢驗(yàn)進(jìn)行比較。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 各組細(xì)胞增殖率比較 bP＜0.001 vs空白對照組;dP＜0.001 vs甘露醇對照組;fP＜0.001 vs高糖組。

圖2 各組RF/6A細(xì)胞遷移情況(×200) A:空白對照組;B:甘露醇對照組;C:高糖組;D:高糖+APN組。

2 結(jié)果

2.1 APN促進(jìn)高糖條件下的RF/6A細(xì)胞增殖 CCK－8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，空白對照組(100.00%±0.00%)、甘露醇對照組(99.09%±0.46%)、高糖組(71.42%±2.29%)、高糖+APN組(90.87%±1.68%)細(xì)胞增殖率比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=254.16，P＜0.001)?？瞻讓φ战M與甘露醇對照組細(xì)胞增殖率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，提示高滲透壓對細(xì)胞增殖無明顯影響。高糖組細(xì)胞增殖率明顯低于空白對照組和甘露醇對照組(均P＜0.001)，提示高糖培養(yǎng)條件下的細(xì)胞增殖受到明顯抑制。高糖+APN組細(xì)胞增殖率明顯低于空白對照組和甘露醇對照組(均P＜0.001)，而明顯高于高糖組(P＜0.001)，提示 10μg/mL APN處理后細(xì)胞增殖較高糖培養(yǎng)條件下有所增強(qiáng)，但仍然低于正常水平，見圖1。以上結(jié)果表明，高糖條件下細(xì)胞增殖低于對照組，APN對細(xì)胞增殖具有保護(hù)效應(yīng)。

2.2 APN抑制高糖誘導(dǎo)的RF/6A細(xì)胞遷移 Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，空白對照組(121.60±6.02個)、甘露醇對照組(119.60±9.39個)、高糖組(144.20±9.65個)、高糖+APN組(73.00±6.04個)細(xì)胞遷移數(shù)比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=70.28，P＜0.001)?？瞻讓φ战M與甘露醇對照組細(xì)胞遷移數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，提示高滲透壓對細(xì)胞遷移無明顯影響。高糖組細(xì)胞遷移數(shù)明顯高于空白對照組和甘露醇對照組(均P＜0.001)，提示高糖培養(yǎng)條件下細(xì)胞遷移明顯增強(qiáng)。高糖+APN組細(xì)胞遷移數(shù)明顯低于空白對照組、甘露醇對照組和高糖組(均P＜0.001)，提示10μg/mL APN處理后細(xì)胞遷移較高糖培養(yǎng)條件下有所減弱，且低于正常水平，見圖2、3。上述結(jié)果表明，高糖條件可以明顯誘導(dǎo)RF/6A細(xì)胞發(fā)生遷移，而APN作用后對高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移具有明顯的抑制作用。

圖3 各組細(xì)胞遷移數(shù)比較 bP＜0.001 vs空白對照組;dP＜0.001 vs甘露醇對照組;fP＜0.001 vs高糖組。

2.3 APN抑制高糖誘導(dǎo)的RF/6A細(xì)胞管腔形成Matrigel實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，空白對照組(12.11±0.84個)、甘露醇對照組(12.22±0.96個)、高糖組(16.00±2.90個)、高糖+APN組(7.89±0.38個)細(xì)胞管腔形成數(shù)比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=12.92，P＜0.001)?？瞻讓φ战M與甘露醇對照組細(xì)胞管腔形成數(shù)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，提示高滲透壓對細(xì)胞管腔形成無明顯影響。高糖組細(xì)胞管腔形成數(shù)明顯高于空白對照組和甘露醇對照組(均P＜0.05)，提示高糖培養(yǎng)條件下細(xì)胞管腔形成明顯增強(qiáng)。高糖+APN組細(xì)胞管腔形成數(shù)明顯低于空白對照組和甘露醇對照組(均P＜0.05)，也明顯低于高糖組(P＜0.001)，提示10μg/mL APN處理后細(xì)胞管腔形成較高糖培養(yǎng)條件下有所減弱，且低于正常水平，見圖4、5。上述結(jié)果表明，高糖條件可以明顯誘導(dǎo)RF/6A細(xì)胞的血管形成，而APN作用后對高糖誘導(dǎo)的血管形成具有抑制作用。

3 討論

高血糖是DM最基本的病理生理狀態(tài)，在DM血管并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。高血糖導(dǎo)致的血管滲透性增加，炎癥和內(nèi)皮細(xì)胞損傷是DR發(fā)生發(fā)展的基礎(chǔ)［14］。本研究提示，高糖處理48h可以明顯減少細(xì)胞增殖，導(dǎo)致細(xì)胞活力下降，與我們前期采用MTT實(shí)驗(yàn)獲得的研究結(jié)果一致［15］。普遍認(rèn)為，CCK－8檢測的重復(fù)性可能優(yōu)于MTT，結(jié)果變異率小，對細(xì)胞毒性小。高糖條件下培養(yǎng)的RF/6A細(xì)胞遷移和管腔形成能力明顯較空白對照組及甘露醇對照組增強(qiáng)，提示高糖是刺激血管生成的直接因素，與文獻(xiàn)報道一致［15－16］。

圖4 各組RF/6A細(xì)胞管腔形成情況(×100) A:空白對照組;B:甘露醇對照組;C:高糖組;D:高糖+APN組。

圖5 各組細(xì)胞管腔形成數(shù)比較 aP＜0.05 vs空白對照組;cP＜0.05 vs甘露醇對照組;fP＜0.001 vs高糖組。

研究表明，由脂肪細(xì)胞分泌的生物活性物質(zhì)與多種代謝性疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，其中APN已被證明與代謝綜合征、DM及心血管疾病的發(fā)生呈負(fù)相關(guān)關(guān)系［17］。近年研究提示，APN主要作用于胰島B細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、免疫細(xì)胞等靶細(xì)胞［18］，通過多種復(fù)雜信號通路發(fā)揮抗炎、抗氧化應(yīng)激、改善內(nèi)皮細(xì)胞功能及調(diào)節(jié)血管新生的作用，從而影響動脈粥樣硬化進(jìn)展、保護(hù)血管內(nèi)皮和心肌、調(diào)節(jié)微循環(huán)及血管新生［19－21］。血管新生是一個十分復(fù)雜的生物過程，涉及細(xì)胞增殖、遷移、完整的網(wǎng)絡(luò)狀血管形成等多個環(huán)節(jié)，各種血管生長因子和細(xì)胞因子參與其中。關(guān)于內(nèi)皮細(xì)胞血管生成方面的研究提示，APN對血管新生具有雙向調(diào)節(jié)作用:(1)在組織缺血狀態(tài)下，APN可刺激血管新生，建立側(cè)枝循環(huán)，改善缺血組織的血供。DM患者常因血管內(nèi)皮受損、動脈粥樣硬化而影響冠狀動脈及外周肢體的血液供應(yīng)，導(dǎo)致冠心病和肢體壞疽的發(fā)生。對該類患者進(jìn)行血管內(nèi)皮祖細(xì)胞或骨髓單核細(xì)胞移植，誘導(dǎo)其在缺血組織中分化而促使血管重建是一種全新的治療方法［19］。關(guān)于該類細(xì)胞移植治療的研究發(fā)現(xiàn)，APN可促進(jìn)骨髓單核細(xì)胞的存活和增殖，接受細(xì)胞移植治療者必須具有較高的血清APN水平才能有效誘導(dǎo)內(nèi)皮祖細(xì)胞的分化，促進(jìn)血管生成［22］。APN可通過激活腺苷酸活化蛋白激酶－內(nèi)皮型一氧化氮合酶(AMPK－eNOS)信號通路發(fā)揮誘導(dǎo)人臍靜脈血管生成的作用，在小鼠基質(zhì)膠塞實(shí)驗(yàn)和兔角膜新生血管模型中，APN可刺激血管結(jié)構(gòu)的生長［23］。此外，APN可以糾正APN基因敲除小鼠由于缺血應(yīng)激誘導(dǎo)的血管生成受損［24］。在大腦中動脈閉塞的小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，APN的過度表達(dá)明顯促進(jìn)了缺血損傷小鼠大腦的局灶性血管生成［25］。與上述研究結(jié)果相似，本研究結(jié)果表明，APN可以顯著促進(jìn)高糖條件下的RF/6A細(xì)胞的存活及增殖，提示APN對高糖導(dǎo)致的RF/6A細(xì)胞損傷起一定的保護(hù)作用。(2)APN可以抑制某些病理狀態(tài)下新生血管的生成。研究發(fā)現(xiàn)，APN可以通過抑制冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的遷移和增殖發(fā)揮抗血管生成效應(yīng)［26－29］。缺氧導(dǎo)致的APN基因敲除小鼠病理性視網(wǎng)膜血管新生更為嚴(yán)重［10］。研究顯示，給予氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜病變小鼠腹腔注射重組鼠APN蛋白，APN可以通過激活內(nèi)源性eNOS促進(jìn)生理性一氧化氮生成，同時又能抑制活性氧簇(ROS)/活性氮簇(RNS)的產(chǎn)生，在缺血性視網(wǎng)膜病變進(jìn)程中發(fā)揮視網(wǎng)膜血管的保護(hù)作用［29］。本研究發(fā)現(xiàn)，APN可以顯著抑制高糖條件下的RF/6A細(xì)胞遷移和管腔形成，提示APN對病理刺激條件下的血管生成過程起抑制作用，與上述研究結(jié)果一致。

綜上，APN在內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成過程中扮演著不同的角色，其促進(jìn)或抑制效應(yīng)可能與生理或病理?xiàng)l件、內(nèi)皮細(xì)胞類型、APN濃度等有關(guān)。本研究觀察APN對高糖條件下RF/6A細(xì)胞增殖、遷移和管腔形成的作用，結(jié)果提示APN可以抑制高糖對視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，并促進(jìn)其修復(fù)，同時抑制病理性血管生成，但具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。目前，對DR尤其是PDR還缺乏完全有效的治療方法或藥物，本研究結(jié)果提示APN治療DR可能是一種嶄新的思路，進(jìn)一步深入研究APN的具體作用機(jī)制和信號通路很有可為治療PDR提供新方法。