于海杰，關(guān)啟剛，郭 亮，張心剛，孫國(guó)哲

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，遼寧沈陽(yáng) 110001)

目前為止，心血管疾病仍然是導(dǎo)致人類死亡的主要疾病之一［1－2］，多種因素可引起心血管疾病的發(fā)生發(fā)展，其中心肌缺血再灌注損傷引起的心血管疾病受到越來越多學(xué)者的關(guān)注［3－4］。雷公藤內(nèi)酯醇(triptolide，TPL)也稱雷公藤甲素，是從雷公藤中分離得到的一種二萜內(nèi)酯化合物，這種天然化合物具有抗炎、抗氧化應(yīng)激、抗腫瘤等作用［5－6］。研究表明，TPL對(duì)心肌缺氧/復(fù)氧(H/R)損傷具有保護(hù)作用［7］，但是其作用機(jī)制尚未明確。TLR4/MyD88/NF-κB p65是炎癥反應(yīng)中的重要調(diào)節(jié)通路，抑制TLR4/MyD88/NF-κB p65通路的活性可降低心肌H/R損傷時(shí)的炎癥反應(yīng)［8］;另外，Nrf2/HO-1通路亦參與調(diào)節(jié)心肌H/R損傷時(shí)機(jī)體的氧化應(yīng)激水平［9］。所以，本實(shí)驗(yàn)通過體外建立H9c2心肌細(xì)胞H/R損傷模型，初步探討 TPL是否通過調(diào)節(jié)TLR4/MyD88/NF-κB p65和 Nrf2/HO-1信號(hào)通路的活性，發(fā)揮對(duì)心肌H/R損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

H9c2大鼠心肌細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存，雷公藤甲素(美國(guó)MCE公司)先用DMSO配成濃度為1 g/L的母液備用。DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)，胎牛血清(美國(guó) Hyclone公司)，PBS(上海雙螺旋生物科技有限公司)，胰酶(中國(guó)碧云天生物技術(shù)公司)，白介素 Iβ(IL-Iβ)、白介素 6(IL-6)、腫瘤壞死因子 α(TNF-α)ELISA試劑盒、CCK-8試劑、Nrf2抗體、HO-1抗體、TLR4抗體、MyD88抗體、NF-κB p65抗體、羊抗兔 IgG-HRP、內(nèi)參抗體 βactin(萬類生物科技有限公司)，丙二醛(MDA)測(cè)定試劑盒、總超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) H9c2細(xì)胞用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基、置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至密度為90%左右，用PBS洗1次，棄上清，加入適當(dāng)體積的0.25%胰酶消化細(xì)胞，待細(xì)胞變圓后，終止消化，收集細(xì)胞，按1∶2進(jìn)行傳代。

1.2.2 H/R模型的制備及藥物處理 H9c2細(xì)胞生長(zhǎng)至密度為90%左右，將細(xì)胞進(jìn)行傳代，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%左右，將細(xì)胞分為對(duì)照組、H/R組和TPL+H/R組;對(duì)照組細(xì)胞于常氧條件下培養(yǎng)，H/R組細(xì)胞常氧條件下培養(yǎng)3 d后用Hank＇s液漂洗、用不含F(xiàn)BS和葡萄糖的培養(yǎng)基替換正常培養(yǎng)基、細(xì)胞于缺氧條件下(95%N2、5%CO2)處理7 h、然后于常氧條件下培養(yǎng) 2 h［5－6］;TPL+H/R 組細(xì)胞常氧條件下培養(yǎng)1 d后，用濃度為20μg/L的TPL處理 48 h［7］，用 Hank＇s液漂洗，用不含 FBS 和葡萄糖的培養(yǎng)基替換正常培養(yǎng)基后，細(xì)胞于缺氧條件下(95%N2、5%CO2)處理7 h后，然后于常氧條件下培養(yǎng)2 h。倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)與形態(tài)變化。

1.2.3 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖情況 將H9c2細(xì)胞接種于96孔板中，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，每孔細(xì)胞量為4×103個(gè)，分組與藥物處理同“1.2.2”，然后每孔每100μL培養(yǎng)基加入10μL CCK-8，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h，在酶標(biāo)儀上測(cè)定其在450 nm處的OD值。

1.2.4 細(xì)胞上清液中 TNF-α、IL-6、IL-1β、MDA 水平及SOD活性的測(cè)定 H9c2細(xì)胞分組與藥物處理同“1.2.2”，然后收集細(xì)胞上清液，按試劑盒說明書操作，檢測(cè)各組細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6、IL-1β、MDA水平及SOD活性。

1.2.5 Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞中 Nrf2、HO-1、TLR4、MyD88及胞核中 NF-κB p65的表達(dá) H9c2細(xì)胞分組與藥物處理同“1.2.2”，收集細(xì)胞，提取相應(yīng)的蛋白后，測(cè)定蛋白濃度。將各組蛋白稀釋后，取20μL(含40μg蛋白)樣本行 SDS-PAGE，SDS-PAGE電泳結(jié)束后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h后，滴加 Nrf2、HO-1、TLR4、MyD88、NF-κB 一抗(1∶500 稀釋)，內(nèi)參 β-actin 和Histon H3抗體(1∶1 000稀釋)4℃孵育過夜，洗膜后用相應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h，化學(xué)發(fā)光劑進(jìn)行化學(xué)發(fā)光后，將膠片進(jìn)行掃描，用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目的條帶光密度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，使用GraphPad Prism 5.0軟件繪制統(tǒng)計(jì)圖，組間差異比較采用單因素方差(one-way ANOVA)分析，所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)至少3次，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 H9c2細(xì)胞形態(tài)

在倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞，其中對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，細(xì)胞呈典型的梭形;與對(duì)照組相比，雖然H/R組細(xì)胞膜還保持相對(duì)完整，但其形態(tài)已明顯破壞，發(fā)生皺縮，且圓形漂浮的細(xì)胞數(shù)目明顯增多;與H/R組相比，經(jīng)過TPL預(yù)處理的細(xì)胞，其生長(zhǎng)狀態(tài)較好，皺縮現(xiàn)象減輕，圓形漂浮細(xì)胞數(shù)目明顯減少。見圖1。

圖1 各組H9c2心肌細(xì)胞形態(tài)(200×)Fig.1 The effect of TPL on H/R-mediated morphological changes of H9c2 cardiomyocytes

2.2 H9c2細(xì)胞增殖

與對(duì)照組相比，H/R組細(xì)胞增殖受到明顯抑制，OD值顯著降低(P＜0.01);與H/R組相比，經(jīng)過TPL預(yù)處理的細(xì)胞，其增殖抑制情況得到改善，OD值顯著升高(P＜0.05)。見表1。

表1 各組H9c2心肌細(xì)胞增殖情況(±s)Tab.1 The effect of TPL on H/R-mediated proliferation of H9c2 cardiomyocytes

表1 各組H9c2心肌細(xì)胞增殖情況(±s)Tab.1 The effect of TPL on H/R-mediated proliferation of H9c2 cardiomyocytes

(1)與對(duì)照組比較，P＜0.01;(2)與H/R組比較，P＜0.05

組別 OD值對(duì)照組1.312±0.135 H/R組 0.943±0.071(1)TPL+H/R組 1.176±0.120(2)

2.3 H9c2細(xì)胞上清液中MDA水平及SOD活性

與對(duì)照組相比，H/R組MDA水平顯著上升、SOD活性顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);與H/R組相比，經(jīng)過TPL預(yù)處理的細(xì)胞，MDA水平顯著下降，SOD活性顯著上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。見表2。

表2 各組H9c2心肌細(xì)胞上清液中MDA水平及SOD活性(±s)Tab.2 The effect of TPL on H/R-mediated MDA and SOD secretion

表2 各組H9c2心肌細(xì)胞上清液中MDA水平及SOD活性(±s)Tab.2 The effect of TPL on H/R-mediated MDA and SOD secretion

(1)與對(duì)照組相比，P＜0.01;(2)與H/R組相比，P＜0.01

組別H9c2細(xì)胞上清液MDA(mol/L) SOD活力(U/mL)對(duì)照組4.099±0.920 13.629±2.719 H/R組 9.790±1.975(1) 5.436±1.220(1)TPL+H/R組 5.506±1.246(2) 9.492±1.914(2)

2.4 H9c2細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6及IL-1β水平

與對(duì)照組比，H/R組細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6、IL-1β的含量均顯著上升(P＜0.01);與H/R組相比，經(jīng)過TPL預(yù)處理的細(xì)胞，其上清液中促炎因子的含量均顯著下降(P＜0.01)，均趨向?qū)φ战M數(shù)值。見表3。

表3 各組H9c2心肌細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6及IL-1β水平( ± s，ng/L)Tab.3 The effect of TPL on H/R-mediated secretion levels of inflammatory factors

表3 各組H9c2心肌細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6及IL-1β水平( ± s，ng/L)Tab.3 The effect of TPL on H/R-mediated secretion levels of inflammatory factors

(1)與對(duì)照組相比，P＜0.01;(2)與H/R組相比，P＜0.01

組別H9c2細(xì)胞上清液TNF-α IL-6 IL-1β對(duì)照組85.364±17.151 52.749±10 763 24.695±5.295 H/R組 221.924±45.227(1) 154.017±32.251(1) 71.137±14.387(1)TPL+H/R組 126.637±26.267(2) 89.224±17.930(2) 39.167±7.906(2)

2.5 H9c2 細(xì)胞中 Nrf2、HO-1、TLR4、MyD88 及胞核中NF-κB p65的表達(dá)

與對(duì)照組比較，H/R組細(xì)胞中 Nrf2、HO-1、TLR4、MyD88及胞核中 NF-κB p65的表達(dá)水平均顯著上調(diào)(P＜0.001);與H/R組相比，經(jīng)過TPL預(yù)處理的細(xì)胞中Nrf2、HO-1進(jìn)一步上調(diào)，而TLR4、MyD88及胞核中NF-κB p65卻顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。見圖2。

圖2 各組H9c2心肌細(xì)胞中Nrf2、HO-1、TLR4、MyD88及NF-κB p65蛋白表達(dá)水平Fig.2 The effect of TPL on the protein levels of H/R-mediated signaling pathways

3 討論

雷公藤是一種傳統(tǒng)的中藥，一直以來用于治療自身免疫性和炎癥性疾病，TPL是其主要生物活性成分，目前已經(jīng)在多種疾病中被證明具有抗癌、抗炎、抗氧化應(yīng)激等作用［5－7］，但其對(duì)心肌的保護(hù)作用機(jī)制尚不完全清楚。

TLR4主要表達(dá)于心肌細(xì)胞［10］，當(dāng)細(xì)胞外界環(huán)境發(fā)生變化時(shí)，如缺氧復(fù)氧的變化，機(jī)體首先選擇開啟先天性免疫應(yīng)答過程，上調(diào)TLR4的表達(dá)，TLR4的上調(diào)可激活其下游MyD88依賴性途徑，進(jìn)而激活 NF-κB，促使其入核，NF-κB入核后啟動(dòng)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)細(xì)胞因子的釋放，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞損傷的發(fā)生［8，11］。H/R變化使 H9c2心肌細(xì)胞中TLR4/MyD88/NF-κB p65信號(hào)通路被激活，同時(shí)也使炎癥相關(guān)因子TNF-α、IL-6、IL-1β的釋放增加。而雷公藤甲素是否通過調(diào)節(jié)TLR4/MyD88/NF-κB p65信號(hào)通路，發(fā)揮抗炎作用的報(bào)道還較少，于是本研究用TPL預(yù)處理H9c2心肌細(xì)胞48 h后，再改變培養(yǎng)條件，研究結(jié)果表明，TPL處理后，細(xì)胞的形態(tài)及其增殖抑制情況均改善，且TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表達(dá)下調(diào)，促炎因子的釋放也顯著降低，提示 TPL可能通過抑制 TLR4/MyD88/NF-κB p65信號(hào)通路，發(fā)揮抗炎作用，從而保護(hù)心肌免遭H/R的損傷。

Nrf2是轉(zhuǎn)錄因子亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄激活因子的家族成員，可通過激活其下游分子HO-1，參與多種器官的抗氧化應(yīng)激損傷過程［12－14］，當(dāng)機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激時(shí)，Nrf2從Keap1-Nrf2復(fù)合物上游離出來，進(jìn)入細(xì)胞核后，與下游的多效應(yīng)靶基因ARE結(jié)合，促進(jìn) HO-1 的轉(zhuǎn)錄［15－17］。HO-1 是一種重要的抗氧化酶，在正常情況下，HO-1的表達(dá)與活力較低，但在應(yīng)激條件下，如缺氧復(fù)氧的改變，HO-1的表達(dá)會(huì)上調(diào)，增加機(jī)體抗氧化應(yīng)激能力，是重要的機(jī)體內(nèi)源性保護(hù)體系之一［18－19］。本研究結(jié)果顯示，H/R可上調(diào)細(xì)胞中Nrf2和HO-1蛋白的表達(dá)水平，可見在外界條件改變時(shí)，機(jī)體可激活其內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制。當(dāng)用TPL預(yù)處理H9c2心肌細(xì)胞48 h后，再進(jìn)行缺氧復(fù)氧處理，Nrf2和HO-1的表達(dá)會(huì)進(jìn)一步增加，同時(shí)顯著降低MDA水平，增加SOD活力。提示TPL也可能通過進(jìn)一步激活Nrf2/HO-1信號(hào)通路，提高心肌細(xì)胞的抗氧化應(yīng)激能力，防止H/R的損傷。這與Yu H等［20］通過大鼠先腹腔內(nèi)注射TPL，再建立心肌缺血再灌注模型，然后進(jìn)行的檢測(cè)結(jié)果相一致。

綜上所述，TPL可能通過進(jìn)一步激活 Nrf2/HO-1信號(hào)通路，提高心肌細(xì)胞抗氧化應(yīng)激的能力，同時(shí)通過抑制 TLR4/MyD88/NF-κB p65信號(hào)通路，緩解炎癥反應(yīng)，從而發(fā)揮心肌保護(hù)作用。本研究結(jié)果可為TPL保護(hù)心肌H/R損傷機(jī)制的研究提供一定的參考，也可為TPL的臨床應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)，及臨床開發(fā)心血管疾病相關(guān)藥物提供新思路。