于海杰，關(guān)啟剛，郭 亮，張心剛，孫國哲

(中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院，遼寧沈陽 110001)

目前為止，心血管疾病仍然是導致人類死亡的主要疾病之一［1－2］，多種因素可引起心血管疾病的發(fā)生發(fā)展，其中心肌缺血再灌注損傷引起的心血管疾病受到越來越多學者的關(guān)注［3－4］。雷公藤內(nèi)酯醇(triptolide，TPL)也稱雷公藤甲素，是從雷公藤中分離得到的一種二萜內(nèi)酯化合物，這種天然化合物具有抗炎、抗氧化應激、抗腫瘤等作用［5－6］。研究表明，TPL對心肌缺氧/復氧(H/R)損傷具有保護作用［7］，但是其作用機制尚未明確。TLR4/MyD88/NF-κB p65是炎癥反應中的重要調(diào)節(jié)通路，抑制TLR4/MyD88/NF-κB p65通路的活性可降低心肌H/R損傷時的炎癥反應［8］;另外，Nrf2/HO-1通路亦參與調(diào)節(jié)心肌H/R損傷時機體的氧化應激水平［9］。所以，本實驗通過體外建立H9c2心肌細胞H/R損傷模型，初步探討 TPL是否通過調(diào)節(jié)TLR4/MyD88/NF-κB p65和 Nrf2/HO-1信號通路的活性，發(fā)揮對心肌H/R損傷的保護作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

H9c2大鼠心肌細胞由本實驗室保存，雷公藤甲素(美國MCE公司)先用DMSO配成濃度為1 g/L的母液備用。DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)，胎牛血清(美國 Hyclone公司)，PBS(上海雙螺旋生物科技有限公司)，胰酶(中國碧云天生物技術(shù)公司)，白介素 Iβ(IL-Iβ)、白介素 6(IL-6)、腫瘤壞死因子 α(TNF-α)ELISA試劑盒、CCK-8試劑、Nrf2抗體、HO-1抗體、TLR4抗體、MyD88抗體、NF-κB p65抗體、羊抗兔 IgG-HRP、內(nèi)參抗體 βactin(萬類生物科技有限公司)，丙二醛(MDA)測定試劑盒、總超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) H9c2細胞用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基、置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，待細胞生長至密度為90%左右，用PBS洗1次，棄上清，加入適當體積的0.25%胰酶消化細胞，待細胞變圓后，終止消化，收集細胞，按1∶2進行傳代。

1.2.2 H/R模型的制備及藥物處理 H9c2細胞生長至密度為90%左右，將細胞進行傳代，待細胞生長至80%左右，將細胞分為對照組、H/R組和TPL+H/R組;對照組細胞于常氧條件下培養(yǎng)，H/R組細胞常氧條件下培養(yǎng)3 d后用Hank＇s液漂洗、用不含F(xiàn)BS和葡萄糖的培養(yǎng)基替換正常培養(yǎng)基、細胞于缺氧條件下(95%N2、5%CO2)處理7 h、然后于常氧條件下培養(yǎng) 2 h［5－6］;TPL+H/R 組細胞常氧條件下培養(yǎng)1 d后，用濃度為20μg/L的TPL處理 48 h［7］，用 Hank＇s液漂洗，用不含 FBS 和葡萄糖的培養(yǎng)基替換正常培養(yǎng)基后，細胞于缺氧條件下(95%N2、5%CO2)處理7 h后，然后于常氧條件下培養(yǎng)2 h。倒置顯微鏡下觀察各組細胞的生長狀態(tài)與形態(tài)變化。

1.2.3 CCK-8檢測細胞增殖情況 將H9c2細胞接種于96孔板中，每組設(shè)置5個復孔，每孔細胞量為4×103個，分組與藥物處理同“1.2.2”，然后每孔每100μL培養(yǎng)基加入10μL CCK-8，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h，在酶標儀上測定其在450 nm處的OD值。

1.2.4 細胞上清液中 TNF-α、IL-6、IL-1β、MDA 水平及SOD活性的測定 H9c2細胞分組與藥物處理同“1.2.2”，然后收集細胞上清液，按試劑盒說明書操作，檢測各組細胞上清液中TNF-α、IL-6、IL-1β、MDA水平及SOD活性。

1.2.5 Western blot檢測各組細胞中 Nrf2、HO-1、TLR4、MyD88及胞核中 NF-κB p65的表達 H9c2細胞分組與藥物處理同“1.2.2”，收集細胞，提取相應的蛋白后，測定蛋白濃度。將各組蛋白稀釋后，取20μL(含40μg蛋白)樣本行 SDS-PAGE，SDS-PAGE電泳結(jié)束后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h后，滴加 Nrf2、HO-1、TLR4、MyD88、NF-κB 一抗(1∶500 稀釋)，內(nèi)參 β-actin 和Histon H3抗體(1∶1 000稀釋)4℃孵育過夜，洗膜后用相應的辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育2 h，化學發(fā)光劑進行化學發(fā)光后，將膠片進行掃描，用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目的條帶光密度值。

1.3 統(tǒng)計學方法

實驗數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標準差(±s)表示，使用GraphPad Prism 5.0軟件繪制統(tǒng)計圖，組間差異比較采用單因素方差(one-way ANOVA)分析，所有實驗重復至少3次，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 H9c2細胞形態(tài)

在倒置顯微鏡下觀察各組細胞，其中對照組細胞生長狀態(tài)良好，細胞呈典型的梭形;與對照組相比，雖然H/R組細胞膜還保持相對完整，但其形態(tài)已明顯破壞，發(fā)生皺縮，且圓形漂浮的細胞數(shù)目明顯增多;與H/R組相比，經(jīng)過TPL預處理的細胞，其生長狀態(tài)較好，皺縮現(xiàn)象減輕，圓形漂浮細胞數(shù)目明顯減少。見圖1。

圖1 各組H9c2心肌細胞形態(tài)(200×)Fig.1 The effect of TPL on H/R-mediated morphological changes of H9c2 cardiomyocytes

2.2 H9c2細胞增殖

與對照組相比，H/R組細胞增殖受到明顯抑制，OD值顯著降低(P＜0.01);與H/R組相比，經(jīng)過TPL預處理的細胞，其增殖抑制情況得到改善，OD值顯著升高(P＜0.05)。見表1。

表1 各組H9c2心肌細胞增殖情況(±s)Tab.1 The effect of TPL on H/R-mediated proliferation of H9c2 cardiomyocytes

表1 各組H9c2心肌細胞增殖情況(±s)Tab.1 The effect of TPL on H/R-mediated proliferation of H9c2 cardiomyocytes

(1)與對照組比較，P＜0.01;(2)與H/R組比較，P＜0.05

組別 OD值對照組1.312±0.135 H/R組 0.943±0.071(1)TPL+H/R組 1.176±0.120(2)

2.3 H9c2細胞上清液中MDA水平及SOD活性

與對照組相比，H/R組MDA水平顯著上升、SOD活性顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);與H/R組相比，經(jīng)過TPL預處理的細胞，MDA水平顯著下降，SOD活性顯著上升，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。見表2。

表2 各組H9c2心肌細胞上清液中MDA水平及SOD活性(±s)Tab.2 The effect of TPL on H/R-mediated MDA and SOD secretion

表2 各組H9c2心肌細胞上清液中MDA水平及SOD活性(±s)Tab.2 The effect of TPL on H/R-mediated MDA and SOD secretion

(1)與對照組相比，P＜0.01;(2)與H/R組相比，P＜0.01

組別H9c2細胞上清液MDA(mol/L) SOD活力(U/mL)對照組4.099±0.920 13.629±2.719 H/R組 9.790±1.975(1) 5.436±1.220(1)TPL+H/R組 5.506±1.246(2) 9.492±1.914(2)

2.4 H9c2細胞上清液中TNF-α、IL-6及IL-1β水平

與對照組比，H/R組細胞上清液中TNF-α、IL-6、IL-1β的含量均顯著上升(P＜0.01);與H/R組相比，經(jīng)過TPL預處理的細胞，其上清液中促炎因子的含量均顯著下降(P＜0.01)，均趨向?qū)φ战M數(shù)值。見表3。

表3 各組H9c2心肌細胞上清液中TNF-α、IL-6及IL-1β水平( ± s，ng/L)Tab.3 The effect of TPL on H/R-mediated secretion levels of inflammatory factors

表3 各組H9c2心肌細胞上清液中TNF-α、IL-6及IL-1β水平( ± s，ng/L)Tab.3 The effect of TPL on H/R-mediated secretion levels of inflammatory factors

(1)與對照組相比，P＜0.01;(2)與H/R組相比，P＜0.01

組別H9c2細胞上清液TNF-α IL-6 IL-1β對照組85.364±17.151 52.749±10 763 24.695±5.295 H/R組 221.924±45.227(1) 154.017±32.251(1) 71.137±14.387(1)TPL+H/R組 126.637±26.267(2) 89.224±17.930(2) 39.167±7.906(2)

2.5 H9c2 細胞中 Nrf2、HO-1、TLR4、MyD88 及胞核中NF-κB p65的表達

與對照組比較，H/R組細胞中 Nrf2、HO-1、TLR4、MyD88及胞核中 NF-κB p65的表達水平均顯著上調(diào)(P＜0.001);與H/R組相比，經(jīng)過TPL預處理的細胞中Nrf2、HO-1進一步上調(diào)，而TLR4、MyD88及胞核中NF-κB p65卻顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)。見圖2。

圖2 各組H9c2心肌細胞中Nrf2、HO-1、TLR4、MyD88及NF-κB p65蛋白表達水平Fig.2 The effect of TPL on the protein levels of H/R-mediated signaling pathways

3 討論

雷公藤是一種傳統(tǒng)的中藥，一直以來用于治療自身免疫性和炎癥性疾病，TPL是其主要生物活性成分，目前已經(jīng)在多種疾病中被證明具有抗癌、抗炎、抗氧化應激等作用［5－7］，但其對心肌的保護作用機制尚不完全清楚。

TLR4主要表達于心肌細胞［10］，當細胞外界環(huán)境發(fā)生變化時，如缺氧復氧的變化，機體首先選擇開啟先天性免疫應答過程，上調(diào)TLR4的表達，TLR4的上調(diào)可激活其下游MyD88依賴性途徑，進而激活 NF-κB，促使其入核，NF-κB入核后啟動相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，促進細胞因子的釋放，進而導致細胞損傷的發(fā)生［8，11］。H/R變化使 H9c2心肌細胞中TLR4/MyD88/NF-κB p65信號通路被激活，同時也使炎癥相關(guān)因子TNF-α、IL-6、IL-1β的釋放增加。而雷公藤甲素是否通過調(diào)節(jié)TLR4/MyD88/NF-κB p65信號通路，發(fā)揮抗炎作用的報道還較少，于是本研究用TPL預處理H9c2心肌細胞48 h后，再改變培養(yǎng)條件，研究結(jié)果表明，TPL處理后，細胞的形態(tài)及其增殖抑制情況均改善，且TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表達下調(diào)，促炎因子的釋放也顯著降低，提示 TPL可能通過抑制 TLR4/MyD88/NF-κB p65信號通路，發(fā)揮抗炎作用，從而保護心肌免遭H/R的損傷。

Nrf2是轉(zhuǎn)錄因子亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄激活因子的家族成員，可通過激活其下游分子HO-1，參與多種器官的抗氧化應激損傷過程［12－14］，當機體發(fā)生氧化應激時，Nrf2從Keap1-Nrf2復合物上游離出來，進入細胞核后，與下游的多效應靶基因ARE結(jié)合，促進 HO-1 的轉(zhuǎn)錄［15－17］。HO-1 是一種重要的抗氧化酶，在正常情況下，HO-1的表達與活力較低，但在應激條件下，如缺氧復氧的改變，HO-1的表達會上調(diào)，增加機體抗氧化應激能力，是重要的機體內(nèi)源性保護體系之一［18－19］。本研究結(jié)果顯示，H/R可上調(diào)細胞中Nrf2和HO-1蛋白的表達水平，可見在外界條件改變時，機體可激活其內(nèi)源性保護機制。當用TPL預處理H9c2心肌細胞48 h后，再進行缺氧復氧處理，Nrf2和HO-1的表達會進一步增加，同時顯著降低MDA水平，增加SOD活力。提示TPL也可能通過進一步激活Nrf2/HO-1信號通路，提高心肌細胞的抗氧化應激能力，防止H/R的損傷。這與Yu H等［20］通過大鼠先腹腔內(nèi)注射TPL，再建立心肌缺血再灌注模型，然后進行的檢測結(jié)果相一致。

綜上所述，TPL可能通過進一步激活 Nrf2/HO-1信號通路，提高心肌細胞抗氧化應激的能力，同時通過抑制 TLR4/MyD88/NF-κB p65信號通路，緩解炎癥反應，從而發(fā)揮心肌保護作用。本研究結(jié)果可為TPL保護心肌H/R損傷機制的研究提供一定的參考，也可為TPL的臨床應用奠定理論基礎(chǔ)，及臨床開發(fā)心血管疾病相關(guān)藥物提供新思路。