陳艷花 ，連 方，張雪洛，柳俊珍，崔向榮

（1.山西省婦幼保健院，山西太原030013； 2.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東濟(jì)南250011）

人類輔助生殖技術(shù)（Assisted reproductive technology，ART）的發(fā)展已經(jīng)為眾多的不孕患者帶來了希望，但其臨床妊娠率仍在40%左右。提高臨床妊娠率已成為近年來研究熱點(diǎn)，改善卵母細(xì)胞質(zhì)量，進(jìn)而提高臨床妊娠率成為一個(gè)突破口。最近研究顯示膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（GDNF）可以顯著增加第一極體排出率，促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟［1］。本研究選取經(jīng)驗(yàn)方二至天癸顆粒，研究對雌性超排卵小鼠GDNF相關(guān)指標(biāo)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 動(dòng)物與分組 健康清潔級(jí)未經(jīng)產(chǎn)8～10 w成熟雌性昆明種小鼠 165只，體質(zhì)量（30±2）g，山東中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK（魯）20030004。按規(guī)定條件飼養(yǎng)，按照隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠按1∶1∶1隨機(jī)分為3組，每組55只。均在動(dòng)情后期用藥。治療1組［中藥配合人絕經(jīng)后促性腺激素（HMG）取卵組］50只，對照1組（HMG取卵組）50只，空白1組50只（取卵組）；治療2組（中藥配合HMG取胚組）5只，對照2組（HMG取胚組）5只，空白2組5只。

所有小鼠連續(xù)每日定時(shí)（18∶00）灌胃給藥（治療組用二至天癸顆粒，對照組及空白組用等量生理鹽水），第11日18∶00，治療組與對照組同時(shí)腹腔注射HMG10 IU，48 h后治療1組脫頸處死小鼠，取GV期DOs，觀察PB1排出，收集卵母細(xì)胞；空白組在相同時(shí)間，取GV期卵母細(xì)胞。

治療2組與對照2組小鼠第11日18∶00腹腔注射HMG10 IU，48 h后腹腔注射HCG10 IU，注射HCG同時(shí)，將各組第2組5只小鼠按雌雄1∶1比例合籠飼養(yǎng)，次日8∶00觀察陰道栓，見陰道栓日為孕1 d，合籠40 h后同上法處死小鼠，解剖取出輸卵管，TB針沖洗一端，使受精卵從另一端流出，收集受精卵于含P-1液的四孔培養(yǎng)皿中，觀察卵裂、形成囊胚能力情況?？瞻捉M于確定發(fā)現(xiàn)陰道動(dòng)情周期當(dāng)天為第0天，即合籠，第2天晨發(fā)現(xiàn)陰道栓后為妊娠第1天。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與藥品 注射用尿促性素（HMG）：商品名：樂寶得，75 U/支。注射用絨促性素（HCG）：1 000 U/支，均出自麗珠集團(tuán)麗珠制藥廠，產(chǎn)品批號(hào)分別為：090202B和090415B。胚胎實(shí)驗(yàn)室用液體均為美國Irvine公司產(chǎn)品，引物由山東博尚生物技術(shù)有限公司合成。二至天癸顆粒：女貞子、旱蓮草、菟絲子、枸杞子、制香附、當(dāng)歸、川芎、白芍、熟地黃、炙甘草等藥物組成。由山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院制劑室提供（批號(hào)：FZ032-03），規(guī)格：3 g/袋。

1.2 方 法

1.2.1 動(dòng)物基本狀態(tài) 觀察3組小鼠的基本外貌及活動(dòng)狀態(tài)變化。

1.2.2 動(dòng)情周期觀察［2］本研究中采用小鼠陰道脫落細(xì)胞學(xué)方法：暴露陰道，用無菌小棉簽蘸少許生理鹽水，然后在小鼠陰道側(cè)壁上1/3處輕涂，將分泌物涂于玻片上，要求薄而均勻，之后用95%乙醇固定，HE染色，玻片顯微鏡下觀察，每日晨涂片，直到動(dòng)物處死。

1.2.3 第1組小鼠 GVBD及PB1的觀察 GV期裸卵（DOs）的收集：每只小鼠腹腔注射HMG10 IU后48 h，處死小鼠，取出雙側(cè)卵巢，肉眼見卵巢增大，卵巢表面突出許多大小不等的卵泡，體視顯微鏡下用精微儀器盡量去除卵巢周圍組織，HTF液中快速洗3遍，在重新?lián)Q液后扎刺卵泡，釋放卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合物（cumulus-oocyte complexs，COCs），輕輕吹打，使卵母細(xì)胞裸露，吸取GV期DOs并移至平衡好的微滴中培養(yǎng)6 h。解剖顯微鏡下觀察GVBD發(fā)生情況。GVBD率為已發(fā)生GVBD的卵母細(xì)胞占全部培養(yǎng)的GV期卵母細(xì)胞百分率。GV期卵母細(xì)胞在培養(yǎng)后24 h觀察PB1的排出，計(jì)算PB1排出率。

1.2.4 第2組小鼠受精卵的卵裂及形成囊胚能力將受精卵置于HTF培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定時(shí)觀察受精卵的發(fā)育情況。在正常情況下，2 細(xì)胞期鼠胚培養(yǎng) 24 h、48 h、72 h、96 h 后分別發(fā)育到8細(xì)胞期、桑椹胚期、囊胚期及擴(kuò)張期囊胚。計(jì)算囊胚形成率以擴(kuò)張期囊胚為準(zhǔn)。

1.2.5 小鼠卵母細(xì)胞 GDNF、GFR-1mRNA 的表達(dá)一步法提取卵母細(xì)胞總mRNA。RNA濃度和純度則由紫外分光光度儀來驗(yàn)證。隨后合成cDNA。取cDNA第一鏈作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得244 bp的小鼠GDNF、580 bp的小鼠GFR-1和374 bp的β-actin基因片段。應(yīng)用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)RT-PCR擴(kuò)增引物。DNA電泳觀察鑒定后分析圖像，并進(jìn)行光密度定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩組資料組間比較采用t檢驗(yàn)；兩分類資料采用卡方檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 小鼠的基本狀態(tài)及動(dòng)情周期觀察

3組小鼠喂養(yǎng)期間表現(xiàn)基本一致，動(dòng)情周期4 d左右，均毛發(fā)一般、情緒平穩(wěn)、飲水量適中、大便濕潤。注射HMG后僅表現(xiàn)情緒躁動(dòng)。對照組尤為明顯。3組小鼠動(dòng)情周期完整、正常。

2.2 GV期卵母細(xì)胞GVBD率比較

治療組GV期卵母細(xì)胞GVBD率比對照組明顯增高（P＜0.05）；治療組與空白組 GV 期卵母細(xì)胞GVBD率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見表1。

表1 3組GV期卵母細(xì)胞GVBD率比較

2.3 GV期卵母細(xì)胞PB1排出率比較

結(jié)果見表2。

表2 三組GV期卵母細(xì)胞培養(yǎng)后的24 h后PB1排出率比較

由表2可知，治療組GV期卵母細(xì)胞培養(yǎng)后的24 h PB1的排出率比對照組明顯升高（P＜0.05）；治療組與空白組GV期卵母細(xì)胞培養(yǎng)后24 h PB1的排出率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.4 小鼠受精卵卵裂率和囊胚形成率比較

結(jié)果見表3、表4。

表3 三組小鼠受精卵卵裂率比較

表4 三組小鼠受精卵囊胚形成率比較

由表3、表4可知，治療組與對照組小鼠卵裂率及囊胚形成率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），治療組優(yōu)于對照組；治療組與空白組小鼠卵裂率及囊胚形成率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.5 小鼠卵母細(xì)胞GDNF、GFR-1 mRNA表達(dá)

本實(shí)驗(yàn)中小鼠卵母細(xì)胞GDNF mRNA在RTPCR產(chǎn)物電泳條帶上未見條帶，即GDNF在小鼠卵母細(xì)胞上未表達(dá)。治療組與對照組比較，GFR-1 mRNA的表達(dá)水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）治療組與空白組比較GFR-1 mRNA的表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見表5、圖1。

表5 三組小鼠卵母細(xì)胞GDNF、GFR-1 mRNA表達(dá)的比較 （±s）

表5 三組小鼠卵母細(xì)胞GDNF、GFR-1 mRNA表達(dá)的比較 （±s）

注：與對照組比較，1）P＜0.05

組別 n G F R-1表達(dá) t P治療組 5 0 0.7 0±0.3 0對照組 5 0 0.4 2±0.1 1 1） 6.1 9 6 0.0 0 0空白組 5 0 0.6 6±0.2 4 0.0 1 2 0.9 9 1

圖1 GDNF、GFR-1 mRNA表達(dá)例圖

3 討論

膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（Glial cell linederived neurotrophic factor，GDNF） 是 Lin LF 等［3］首先從大鼠B49膠質(zhì)細(xì)胞系能發(fā)現(xiàn)的一種有活性神經(jīng)營養(yǎng)因子。定量PCR和免疫組化的結(jié)果都表明GDNF的受體GFR-1表達(dá)于卵母細(xì)胞［4］。對于小鼠排卵前，GDNF、GFR-1在顆粒細(xì)胞中的表達(dá)量達(dá)到最高峰，而卵母細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)量保持恒定［5］。將GDNF加入體外培養(yǎng)未成熟的卵丘一卵母復(fù)合物中，GDNF影響GVBD的發(fā)生率，并能顯著增加第一極體的排出率，并且呈劑量依賴關(guān)系［6-7］。

具有補(bǔ)腎益天癸、養(yǎng)血調(diào)沖任功效的二至天癸顆粒組成為菟絲子、女貞子、旱蓮草、枸杞子、熟地、當(dāng)歸、川芎、白芍、制香附、炙甘草等，君藥：女貞子、菟絲子共用，滋補(bǔ)肝腎益精，直中病機(jī)，陰陽并補(bǔ)。臣藥：旱蓮草、枸杞子、熟地，三藥滋補(bǔ)肝腎、填精養(yǎng)血，協(xié)助君藥共奏清補(bǔ)腎陰之功。佐藥：白芍、當(dāng)歸、川芎、制香附，養(yǎng)血疏肝、調(diào)達(dá)沖任，精血互化，以佐君藥滋補(bǔ)腎陰之功。使藥甘草調(diào)和諸藥，以之為使?？v觀全方，補(bǔ)益肝腎、調(diào)達(dá)沖任，正合本病之病機(jī)。全方共奏補(bǔ)腎益天癸，調(diào)理沖任之效，使腎中陰陽平秘，同時(shí)肝腎同源，肝腎并補(bǔ)，精血互化，血旺則精足，腎精盛，天癸充，經(jīng)候自調(diào)，則胎孕可成。

該顆粒具有促卵細(xì)胞發(fā)育、改善生殖內(nèi)分泌環(huán)境、調(diào)整免疫功能及提高子宮內(nèi)膜容受性的中藥整體調(diào)節(jié)作用［8-9］。藥理研究顯示，女貞子中所含女貞子多糖能改善環(huán)磷酰胺造成小鼠免疫低下模型小鼠的免疫作用與機(jī)體的免疫狀態(tài)有關(guān)，對非特異性細(xì)胞免疫有增強(qiáng)作用，對正常小鼠的特異性細(xì)胞免疫無顯著影響，對免疫抑制狀態(tài)小鼠的細(xì)胞免疫有增強(qiáng)作用［10］。齊墩果酸能提高更年期鼠E2、SOD、GSH-Px水平，降低MDA水平；改善卵巢及腎上腺的形態(tài)和功能［11］。旱蓮草煎劑能增加小鼠胸腺重量，明顯提高小鼠碳粒廓清速率，并能增強(qiáng)機(jī)體細(xì)胞免疫機(jī)能，顯著提高小鼠外周血中T淋巴細(xì)胞百分率［12］。菟絲子具有雌激素樣作用［13］，枸杞子具有免疫促進(jìn)和免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗衰老、抗疲勞的作用，對細(xì)胞免疫和體液免疫均具有調(diào)節(jié)機(jī)能。熟地能夠抗氧化、抗衰老、調(diào)節(jié)免疫機(jī)能、降血糖、降血脂，對激素代謝等均有影響。兩者協(xié)同能調(diào)節(jié)生殖功能。芍藥甙對大鼠、豚鼠的離體腸管和在體胃的運(yùn)動(dòng)以及大鼠子宮平滑肌均具有抑制作用，芍藥甙對大鼠子宮平滑肌具有抑制作用，并能拮抗催產(chǎn)素引起的子宮收縮［14］。川芎嗪是其主要有效活性成分，有較強(qiáng)的擴(kuò)張微血管、改善微循環(huán)、降低血黏度、改善血液流變、降低毛細(xì)血管通透性、調(diào)節(jié)血小板功能和抗凝、抑制自由基產(chǎn)生等藥理活性。香附揮發(fā)油有輕度雌激素樣活性。諸藥合用對生殖功能起到改善作用。

本研究提示補(bǔ)腎中藥二至天癸顆粒能提高小鼠卵母細(xì)胞GFR-1受體的表達(dá)，可能直接促進(jìn)裸卵的GVBD和PB1，提高小鼠卵裂率及囊胚形成率。使小鼠卵母細(xì)胞GFR-lmRNA高表達(dá)，從而可能更有利于提高小鼠卵母細(xì)胞質(zhì)量，改善胚胎質(zhì)量。