廖雪艷, 汪克純

(四川省成都市第六人民醫(yī)院, 四川 成都, 610051)

氧化應(yīng)激在心肌缺血再灌注損傷的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用[1-2]。線粒體是氧化應(yīng)激產(chǎn)物的重要細(xì)胞器，其電子傳遞鏈中Ⅰ與Ⅲ復(fù)合體是產(chǎn)生活性氧(ROS)的主要部位。研究[3-4]表明，線粒體與心肌缺血再灌注損傷的各個(gè)環(huán)節(jié)密切相關(guān)。姜黃素是從姜黃中分離出來(lái)的一種相對(duì)分子量低的多酚類化合物。研究[5]發(fā)現(xiàn)姜黃素可以通過(guò)減輕線粒體內(nèi)氧化應(yīng)激、增加抗氧化應(yīng)激酶活性、改善呼吸鏈功能等而改善腎臟、肝臟等細(xì)胞線粒體功能。作者推測(cè)姜黃素可能在氧化應(yīng)激損傷中對(duì)心肌細(xì)胞線粒體也起著重要的保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外培養(yǎng)H9c2心肌細(xì)胞株建立氧化應(yīng)激模型，姜黃素預(yù)處理后觀察氧化應(yīng)激條件下細(xì)胞損傷，線粒體氧化應(yīng)激產(chǎn)物及線粒體形態(tài)功能的變化，探討其在氧化應(yīng)激損傷中對(duì)心肌線粒體的保護(hù)作用及可能機(jī)制，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料

H9c2心肌細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù); 姜黃素購(gòu)自美國(guó)Sigma公司; 過(guò)氧化氫(H2O2)和MTT試劑盒; 活性氧(ROS)探針DCFH-DA、活性氮簇(RNS)探針、線粒體膜電位探針(JC-1)、細(xì)胞線粒體分離試劑盒和ATP測(cè)試試劑盒購(gòu)自江蘇碧云天生物技術(shù)有限公司; 乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和三磷酸腺苷(ATP)酶測(cè)試試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 H9c2心肌細(xì)胞株培養(yǎng)及氧化應(yīng)激模型建立: 將H9c2細(xì)胞接種在無(wú)菌細(xì)胞培養(yǎng)皿中，放置在5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中，用含有10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng), H9c2細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。用無(wú)血清DMEM/F12稀釋H2O2原液，配制成50、100、200、400 μmol/L濃度梯度處理液，分別處理H9c2心肌細(xì)胞6 h，根據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇最佳H2O2干預(yù)濃度，建立H9c2 細(xì)胞氧化應(yīng)激模型。用二甲基亞砜(DMSO)稀釋姜黃素配制成25、50、75、100 μmol/L濃度梯度處理液后，在H2O2處理液干預(yù)前30 min分別處理H9c2心肌細(xì)胞，根據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇最佳姜黃素干預(yù)濃度。

1.2.2 分組及處理: H9c2心肌細(xì)胞按105個(gè)/孔接種于無(wú)菌6孔板上，當(dāng)細(xì)胞密度長(zhǎng)至80%～90%后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。分組及處理: ① 正常對(duì)照組: 將H9c2心肌細(xì)胞接種至正常細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng); ② 模型組(H2O2組): 將H9c2心肌細(xì)胞換無(wú)血清DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h, 然后加入最佳H2O2干預(yù)濃度處理液培養(yǎng)培養(yǎng)6 h; ③ 姜黃素預(yù)處理組(姜黃素組): 將H9c2心肌細(xì)胞在H2O2干預(yù)前30 min加入姜黃素最佳干預(yù)濃度培養(yǎng)處理，余同模型組。

1.2.3 MTT測(cè)細(xì)胞存活率: 根據(jù)MTT試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，將H9c2心肌細(xì)胞按104個(gè)/孔密度接種于無(wú)菌96孔板, DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h用于實(shí)驗(yàn)。用不同濃度H2O2處理液和姜黃素處理液分別干預(yù)細(xì)胞后，每孔加入20 μL (5 mg/mL)MTT試劑, 37 ℃培養(yǎng)箱孵育4 h, 棄上清，加入150 μL DMSO，置于室溫?fù)u床 10 min后用酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)測(cè)光密度(OD值)。

1.2.4 LDH和CK-MB水平檢測(cè): 將H9c2心肌細(xì)胞按105個(gè)/孔密度接種于無(wú)菌6孔板中，相應(yīng)干預(yù)后(詳見分組與處理)取各組細(xì)胞培養(yǎng)液，按照LDH和CK-MB試劑盒說(shuō)明書中操作步驟進(jìn)行操作，應(yīng)用721D分光光度計(jì)測(cè)光密度值，檢測(cè)各組LDH、CK-MB水平，單位為U/L。

1.2.5 透射電鏡檢測(cè)H9c2細(xì)胞線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu): 將H9c2細(xì)胞接種至無(wú)菌細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，按105個(gè)/孔密度接種于無(wú)菌6孔板，細(xì)胞密度長(zhǎng)至80%～90%時(shí)，給予相應(yīng)干預(yù)后，用無(wú)血清DMEM/F12 洗滌3 次，收集細(xì)胞; 然后加入2.5%戊二醛，固定細(xì)胞2 h，再加入1%四氧化鋨，固定細(xì)胞15 min, 室溫脫水，包埋，過(guò)夜，固化，切片，醋酸鈉染色后自然干燥，檸檬酸鉛染色; 晾干后采用透射電鏡觀察各組細(xì)胞線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.2.6 流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)線粒體膜電位: 將H9c2心肌細(xì)胞按105個(gè)/孔密度接種于無(wú)菌6孔板中，給予相應(yīng)干預(yù)后PBS洗滌3次，胰酶消化，用含血清DMEM/F12終止消化后收集細(xì)胞，加入JC-1探針10 μg/mL 37℃孵育20 min，500 μL PBS重懸細(xì)胞后上流式細(xì)胞儀觀察，記錄各組細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度。

1.2.7 細(xì)胞內(nèi)ATP水平檢測(cè): 將H9c2心肌細(xì)胞按105個(gè)/孔密度接種于無(wú)菌6孔板中，給予相應(yīng)干預(yù)后取各組細(xì)胞，裂解后1 600 g離心10 min, 取上清，按照ATP測(cè)試試劑盒說(shuō)明書中操作步驟進(jìn)行操作，酶標(biāo)儀檢測(cè)光密度值(RLU值), BCA蛋白濃度試劑盒測(cè)定各組培養(yǎng)液蛋白濃度，檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)ATP水平，單位為nmol/mg protein。

1.2.8 細(xì)胞線粒體的提取分離、線粒體酶及線粒體SOD和MDA水平檢測(cè): 將H9c2心肌細(xì)胞按105個(gè)/孔密度接種于無(wú)菌6孔板，給予相應(yīng)干預(yù)后取各組細(xì)胞; 按照江蘇碧云天生物技術(shù)有限公司細(xì)胞線粒體分離試劑盒操作。① 將得到的線粒體按照南京建成生物工程研究所線粒體ATP酶試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，檢測(cè)各組線粒體鈉鉀ATP酶(Na+k+-ATPase)和鈣鎂ATP酶(Ca2+Mg2+-ATPase)活性水平，單位為μmol Pi/(mg protein·h)。② 將得到的線粒體按照南京建成生物工程研究所SOD和MDA試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，檢測(cè)各組線粒體內(nèi)SOD和MDA水平，單位分別為U/mg protein和nmol/mg protein。

1.2.9 激光共聚焦檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)和活性氮簇(RNS)水平: 將H9c2心肌細(xì)胞按105個(gè)/孔密度接種于無(wú)菌激光共聚焦皿，給予相應(yīng)干預(yù)后，分別進(jìn)行如下操作: ① 加入ROS探針DCFH-DA 10 μmol/L探針37 ℃孵育15 min; 激光共聚焦顯微鏡成像，激發(fā)波長(zhǎng)488 nm, 發(fā)射波長(zhǎng)525 nm。② 加入用DMSO配制的DHE5 μmol/探針, 37 ℃恒溫孵箱孵育30 min; 激光共聚焦顯微鏡成像，激發(fā)波長(zhǎng)543 nm, 發(fā)射波長(zhǎng)560 nm。Image-ProPlus 6.0軟件分析熒光的強(qiáng)度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度H2O2對(duì)H9c2心肌細(xì)胞存活率的影響(n=3)

用不同濃度H2O2處理H9c2心肌細(xì)胞6 h建立心肌氧化應(yīng)激模型。MTT結(jié)果顯示，隨著H2O2濃度梯度(50、100、200、400 μmol/L)的升高, H9c2心肌細(xì)胞存活率逐漸降低。與對(duì)照組100.00%心肌細(xì)胞存活率相比, 50、100 μmol/L H2O2處理H9c2心肌細(xì)胞6 h, 心肌細(xì)胞存活率分別為(82.79±0.52)%、(74.21±2.03)%, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而200、400 μmol/L處理時(shí)，心肌細(xì)胞存活率分別為(49.05±0.37)%、(28.20±1.05)%, 差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示200 μmol/L濃度的H2O2能夠兼顧體現(xiàn)氧化應(yīng)激損傷和適當(dāng)?shù)募?xì)胞活力，故在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選擇200 μmol/L H2O2作為建立氧化應(yīng)激模型的干預(yù)濃度。

2.2 不同濃度姜黃素對(duì)氧化應(yīng)激損傷H9c2心肌細(xì)胞存活率的影響(n=3)

為了了解姜黃素對(duì)H9c2心肌細(xì)胞存活率的影響，氧化應(yīng)激模型建立前30 min加入不同濃度的姜黃素(25、50、75、100 μmol/L)。MTT結(jié)果顯示，與對(duì)照組100.00%心肌細(xì)胞存活率及H2O2組(46.02±0.76)%心肌細(xì)胞存活率相比，25、50、75、100 μmol/L姜黃素均可顯著改善細(xì)胞存活率(P<0.05), 分別為(62.59±2.50)、(85.28±1.95)、(76.71±0.83)、(73.60±3.57)%，并在姜黃素 50 μmol/L時(shí)達(dá)到最高的H9c2心肌細(xì)胞存活率，故在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選擇50 μmol/L 姜黃素作為干預(yù)濃度。

2.3 姜黃素對(duì)氧化應(yīng)激損傷條件下LDH、CK-MB的影響(n=3)

與對(duì)照組相比，其余各組培養(yǎng)液中的LDH和CK-MB水平顯著升高(P<0.05)。與H2O2組比較，姜黃素組LDH和CK-MB水平顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 姜黃素對(duì)各組LDH、CK-MB水平的影響

LDH: 乳酸脫氫酶; CK-MB: 肌酸激酶同工酶。

與對(duì)照組比較, *P<0.05; 與H2O2組比較, #P<0.05。

2.4 姜黃素對(duì)氧化應(yīng)激損傷條件下心肌細(xì)胞線粒體形態(tài)的影響

透射電鏡觀察結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比, H2O2組H9c2心肌細(xì)胞線粒體腫脹，嵴腫脹結(jié)構(gòu)紊亂，空泡化，密度減低; 與H2O2組相比，姜黃素組H9c2心肌細(xì)胞線粒體腫脹減輕，線粒體嵴腫脹減輕，排列較整齊，空泡化程度明顯減少。見圖1。

2.5 姜黃素對(duì)氧化應(yīng)激損傷條件下心肌細(xì)胞線粒體酶的影響(n=3)

與對(duì)照組相比, H2O2組H9c2心肌細(xì)胞線粒體Na+k+-ATPase和Ca2+Mg2+-ATPase活性顯著降低(P<0.05); 與H2O2組相比，姜黃素組H9c2心肌細(xì)胞線粒體Na+k+-ATPase和Ca2+Mg2+-ATPase活性顯著升高(P<0.05)。見表2。

圖1 透射電鏡觀察姜黃素對(duì)氧化應(yīng)激損傷條件下H9c2心肌細(xì)胞線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響(30 000倍,箭頭所指為線粒體)

表2 姜黃素對(duì)各組細(xì)胞線粒體酶的影響

Na+k+-ATPase: 鈉鉀ATP酶; Ca2+Mg2+-ATPase: 鈣鎂ATP酶。

與對(duì)照組比較, *P<0.05; 與H2O2組比較, #P<0.05。

2.6 姜黃素對(duì)氧化應(yīng)激損傷條件下細(xì)胞ATP水平和線粒體膜電位的影響(n=3)

與對(duì)照組相比較, H2O2組H9c2心肌細(xì)胞中ATP水平和線粒體膜電位顯著降低(P<0.05)。與H2O2組相比，給予姜黃素預(yù)處理能夠顯著升高H9c2心肌細(xì)胞中ATP水平和線粒體膜電位 (P<0.05)。見表3、圖2。

表3 姜黃素對(duì)各組細(xì)胞ATP和線粒體膜電位的影響

ATP: 三磷酸腺苷。與對(duì)照組比較, *P<0.05;

與H2O2組比較, #P<0.05。

2.7 姜黃素對(duì)氧化應(yīng)激損傷條件下心肌細(xì)胞ROS、RNS、MDA和SOD的影響(n=3)

與對(duì)照組相比, H2O2組H9c2心肌細(xì)胞中ROS, RNS和線粒體內(nèi)MDA水平顯著升高，而線粒體內(nèi)SOD水平顯著下降(P<0.05)。與H2O2組相比，姜黃素預(yù)處理能夠顯著降低H9c2心肌細(xì)胞中ROS, RNS和線粒體內(nèi)MDA水平，升高線粒體中SOD水平(P<0.05)。見圖3、4及表4。

3 討 論

心肌細(xì)胞能量供應(yīng)障礙是心肌缺血再灌注損傷的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，線粒體功能障礙在心肌缺血再灌注損傷中起著關(guān)鍵的作用[6-7], 改善線粒體形態(tài)異常和功能障礙可作為減輕心肌缺血再灌注損傷的重要干預(yù)靶點(diǎn)。

本研究發(fā)現(xiàn)，隨著H2O2濃度的升高, H9c2心肌細(xì)胞存活率降低; 給予不同濃度姜黃素預(yù)處理后，可使氧化應(yīng)激條件下H9c2心肌細(xì)胞存活率升高，其中姜黃素 50 μmol/L 時(shí)達(dá)到H9c2心肌細(xì)胞存活率最高，并可顯著降低氧化應(yīng)激條件下LDH和CK-MB水平。上述結(jié)果表明，姜黃素能夠減輕氧化應(yīng)激條件下心肌細(xì)胞的損傷。

細(xì)胞內(nèi)ATP水平與線粒體膜電位高低是反映線粒體功能狀態(tài)的重要指標(biāo)。氧化應(yīng)激損傷可導(dǎo)致線粒體功能障礙，主要表現(xiàn)為ATP產(chǎn)生和線粒體膜電位降低。本研究結(jié)果顯示，氧化應(yīng)激可導(dǎo)致線粒體膜電位降低, ATP生成減少; 給予姜黃素干預(yù)后H9c2心肌細(xì)胞線粒體膜電位升高, ATP生成增加，提示姜黃素可以改善氧化應(yīng)激條件下線粒體功能。

圖2 流式細(xì)胞檢測(cè)H9c2心肌細(xì)胞膜電位水平

圖3 激光共聚焦檢測(cè)H9c2心肌細(xì)胞ROS水平(1 000倍)

圖4 激光共聚焦檢測(cè)H9c2心肌細(xì)胞RNS水平(800倍)

表4 姜黃素對(duì)各組細(xì)胞的ROS、RNS、MDA和SOD影響

ROS: 活性氧; RNS: 活性氮簇; MDA: 丙二醛; SOD: 超氧化物歧化酶。與對(duì)照組比較, *P<0.05; 與H2O2組比較, #P<0.05。

線粒體膜Na+k+-ATPase和Ca2+Mg2+-ATPase是維持線粒體膜流動(dòng)性關(guān)健酶。其活性下降，造成線粒體電解質(zhì)平衡紊亂，線粒體水腫等形態(tài)結(jié)構(gòu)變化，進(jìn)而導(dǎo)致線粒體氧化磷酸化功能障礙, ATP合成不足[8-9]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)透射電鏡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激可導(dǎo)致線粒體水腫，密度降低，線粒體嵴水腫; 給予姜黃素干預(yù)后可減輕線粒體及線粒體嵴的水腫，維持線粒體正常的形態(tài)結(jié)構(gòu)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激導(dǎo)致線粒體膜Na+k+-ATPase和Ca2+Mg2+-ATPase活性降低; 姜黃素干預(yù)后可提高線粒體膜Na+k+-ATPase和Ca2+Mg2+-ATPase活性。上述結(jié)果提示姜黃素可通過(guò)維持氧化應(yīng)激條件下線粒體正常的形態(tài)結(jié)構(gòu)及提高線粒體膜Na+k+-ATPase和Ca2+Mg2+-ATPase活性來(lái)改善線粒體功能。

超氧化物歧化酶(SOD)是細(xì)胞內(nèi)關(guān)鍵的抗氧化超氧歧化物酶類，其水平可以間接反映細(xì)胞內(nèi)抗氧化能力[10]。丙二醛(MDA)是細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的產(chǎn)物，其水平反映了細(xì)胞受自由基攻擊和損傷的程度。為了解姜黃素對(duì)氧化應(yīng)激條件下H9c2心肌細(xì)胞線粒體內(nèi)SOD和MDA的影響，本實(shí)驗(yàn)觀察相應(yīng)干預(yù)條件下H9c2心肌細(xì)胞線粒體內(nèi)SOD和MDA水平的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激條件下, H9c2心肌細(xì)胞線粒體內(nèi)SOD水平降低, MDA水平升高; 給予姜黃素預(yù)處理后, H9c2心肌細(xì)胞線粒體內(nèi)SOD水平升高, MDA水平降低，上述結(jié)果說(shuō)明姜黃素可增強(qiáng)線粒體內(nèi)源性抗氧化能力，減輕線粒體的氧化應(yīng)激損傷。

心肌缺血再灌注后組織恢復(fù)氧灌注會(huì)引起劇烈的線粒體氧化應(yīng)激，主要表現(xiàn)為線粒體內(nèi)活性氧簇(ROS)和活性氮簇(RNS)生成增加[11], 最終導(dǎo)致線粒體功能障礙，表現(xiàn)為線粒體膜電位降低[12-13], 線粒體內(nèi)鈣超載[14-15]等。本研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激條件下，H9c2心肌細(xì)胞線粒體ROS和RNS生成顯著增加; 給予姜黃素預(yù)處理后，線粒體內(nèi)ROS和RNS生成顯著減少。

綜上所述，姜黃素可改善氧化應(yīng)激條件下H9c2心肌細(xì)胞的線粒體形態(tài)和功能，表現(xiàn)為升高線粒體膜電位、增加ATP生成、提高線粒體ATPase活性和維持線粒體正常的形態(tài)結(jié)構(gòu)，其機(jī)制可能與清除細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激產(chǎn)物(如ROS、MDA), 增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)SOD活性有關(guān)。