楊晉生 方軍超 張峰

(河南科技大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院 河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，河南 洛陽 471003)

多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM)是人類最常見的原發(fā)性惡性腦腫瘤，其5年生存率不足10%〔1〕。GBM以腫瘤細(xì)胞呈浸潤性生長為主要特征，進(jìn)展迅速。近年來雖然手術(shù)、放化療技術(shù)得到長足發(fā)展，但GBM患者的預(yù)后仍沒有明顯改善。MicroRNAs(miRNAs)是一類高度保守的非編碼小RNAs，長度為20～24個核苷酸，通過與靶基因miRNAs的3′非編碼區(qū)(UTR)結(jié)合，抑制miRNAs翻譯或促進(jìn)其降解，進(jìn)而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)。研究表明miRNAs參與調(diào)控多種生物學(xué)過程，包括細(xì)胞增殖與分化、細(xì)胞凋亡、發(fā)育與衰老和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等，miRNAs表達(dá)異常與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移和耐藥密切相關(guān)〔2〕。miR-139-5p基因定位于11q13.4，是近年來研究較多的腫瘤相關(guān)性miRNAs之一。已有研究發(fā)現(xiàn)，miR-139-5p在胃癌、肝細(xì)胞癌、乳腺癌、卵巢癌、食管鱗癌、結(jié)直腸癌、白血病等多種腫瘤中低表達(dá)，而且miR-139-5p下調(diào)表達(dá)與轉(zhuǎn)移性腫瘤的特征顯著相關(guān)，包括低分化、包膜缺失、靜脈侵犯等〔3～5〕。因此，通常認(rèn)為miR-139-5p具有類似抑癌基因的活性，然而其在GBM演進(jìn)過程中的功能及機(jī)制鮮有報道〔6，7〕。本研究旨在探索miR-139-5p在GBM患者腦組織中的表達(dá)水平，通過生物信息學(xué)預(yù)測miR-139-5p的靶基因，并對其靶基因進(jìn)行驗證和通路富集分析，為深入研究其在GBM中的功能和機(jī)制及靶向治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 收集2015年10月至2017年8月河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科36例GBM患者手術(shù)切除的腫瘤標(biāo)本，所有標(biāo)本由病理診斷證實，男23例，女13例，年齡21～69歲；14例同期腦外傷減壓切除的正常腦組織標(biāo)本作為對照組，男9例，女5例，年齡23～65歲。收集術(shù)中切除的GBM腫瘤組織和減壓切除的正常腦組織，剪除電灼壞死部分，無菌生理鹽水沖洗后立即浸于液氮，-80℃保存?zhèn)溆?。兩組性別、年齡分布上無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會批準(zhǔn)，患者知情同意。

1.2實時定量PCR檢測miR-139-5p表達(dá)水平 參考TRIzol試劑(Invitrogen)的說明書，提取手術(shù)切除GBM腫瘤組織和正常腦組織的總RNA，-80℃保存?zhèn)溆?。采用Nanodrop檢測總RNA樣品的濃度和純度，瓊脂糖凝膠電泳評估RNA樣品的完整性。以質(zhì)檢合格的總RNA樣品為模板，首先按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT(Takara)的操作說明合成一鏈cDNA，然后根據(jù)熒光定量試劑盒SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(Takara)的說明書配制PCR反應(yīng)液，采用ABI7500實時定量PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems)進(jìn)行擴(kuò)增分析，反應(yīng)程序為95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 30 s，循環(huán)40次。PCR反應(yīng)所用引物由上海生工生物工程公司合成，miR-139-5p反轉(zhuǎn)錄序列5′-GTCAGAAGGAATGATGCACAGCCACTGGAG-3′;qPCR上游引物5′-TCTACAGTGCACGTGTCTCCAG-3′，下游引物5′-ACCTGCGTAGGTAGTTTCATGT-3′。U6反轉(zhuǎn)錄序列5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；qPCR上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。U6基因作為反應(yīng)內(nèi)參，在擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后記錄Ct值，重復(fù)實驗3次，每次3個復(fù)孔，采用2-△△Ct方法評估m(xù)iR-139-5p的相對表達(dá)水平。

1.3miR-139-5p生物信息學(xué)分析 采用starBase〔8〕在線工具篩選miR-139-5p的靶基因，選取預(yù)測結(jié)果的交集。通過TargetScan數(shù)據(jù)庫分析miR-139-5p與靶基因的潛在結(jié)合位點。檢索miRPathDB數(shù)據(jù)庫分析miR-139-5p靶基因顯著富集的pathways〔9〕，并運(yùn)用miRTargetLink工具構(gòu)建miR-139-5p與其靶基因之間的交互網(wǎng)絡(luò)〔10〕。

1.4細(xì)胞培養(yǎng) 人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87(中科院上海細(xì)胞庫)培養(yǎng)在含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中(Gibco)，置于37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.5螢光素酶報告實驗 通過TargetScan數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)真核翻譯起始因子4γ2(EIF4G2)基因mRNA 3′UTR位點351～358是miR-139-5p的潛在結(jié)合位點，利用基因合成技術(shù)合成含該位點的DNA片段及含該位點突變體的DNA片段，分別亞克隆至pGL3報告載體(Promega)，構(gòu)建pGL3-EIF4G2 3′UTR Wild和pGL3-EIF4G2 3′UTR Mut重組質(zhì)粒，并經(jīng)測序鑒定。將U87細(xì)胞以2×105/孔的密度接種于24孔板中培養(yǎng)24 h，然后參考脂質(zhì)體2000試劑盒(Invitrogen)提供的操作流程，將pGL3-EIF4G2 3′UTR Wild或pGL3-EIF4G2 3′UTR Mut和miR-139-5p mimic或陰性對照Negative Control(RiboBio)共同轉(zhuǎn)染U87細(xì)胞，每組設(shè)置3個重復(fù)，培養(yǎng)48 h后裂解細(xì)胞，參照雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒(Promega)說明檢測螢光素酶的活性，實驗重復(fù)3次。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行t及χ2檢驗。

2 結(jié) 果

2.1GBM患者腦組織miR-139-5p表達(dá)水平 采用Nanodrop對所提取的總RNA樣品進(jìn)行純度檢測，結(jié)果可見所有RNA樣品的A260/280均在1.9～2.0，瓊脂糖凝膠電泳實驗表明RNA樣品均完整。實時定量PCR檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組腦組織(1.00±0.09)相比，GBM患者腫瘤組織(0.41±0.12)中miR-139-5p的相對表達(dá)水平顯著下調(diào)(P<0.05)。

2.2miR-139-5p靶基因預(yù)測結(jié)果 starBase工具采用5種算法篩選miRNAs靶基因，TargetScan、PicTar、RNA22、PITA和miRanda分別預(yù)測出219、203、168、214和1 235個miR-139-5p靶基因，取其交集后共得到8個靶基因，包括EIF4G2、ETS1、PDE3A、H2AFV、FBN2、SEPT11、GALNT3和THBS1。

2.3靶基因pathway富集分析結(jié)果 通過檢索miRPathDB數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)miR-139-5p的靶基因顯著富集于胰島素樣生長因子(IGF)-1信號通路、神經(jīng)營養(yǎng)因子(NGF)通路、趨化因子通路、T細(xì)胞受體通路、Ras信號通路和轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β信號通路等(表1)。為了明確miR-139-5p與眾多靶基因之間的關(guān)系，我們運(yùn)用miRTargetLink構(gòu)建了miR-139-5p與其靶基因的交互網(wǎng)絡(luò)，如圖1所示，IGF1R、NOTCH1、ROCK2、PIK3CA、JUN、MCL1等屬于有實驗數(shù)據(jù)支持已證實的miR-139-5p靶基因，且與多個富集通路相關(guān)，可能是miR-139-5p發(fā)揮功能的主要分子機(jī)制。

表1 miR-139-5p靶基因pathway富集分析結(jié)果

圖1 miR-139-5p與其靶基因之間的交互網(wǎng)絡(luò)

2.4miR-139-5p靶向調(diào)控EIF4G2基因表達(dá) 通過starBase工具的5種算法篩選miR-139-5p的靶基因，并結(jié)合系統(tǒng)性文獻(xiàn)檢索，最后選擇EIF4G2基因作為進(jìn)一步研究的目標(biāo)。通過檢索TargetScan數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)EIF4G2基因mRNA 3′UTR位點351～358是miR-139-5p的可能結(jié)合位點，為了證明其靶向調(diào)控關(guān)系，我們構(gòu)建了EIF4G2 3′UTR Wild和EIF4G2 3′UTR Mut報告基因質(zhì)粒，序列見圖2。

螢光素酶報告系統(tǒng)檢測結(jié)果顯示，與pGL3-EIF4G2 3′UTR Wild和miR NC共轉(zhuǎn)染組相比，pGL3-EIF4G2 3′UTR Wild和miR-139-5p mimic共轉(zhuǎn)染組螢光素酶活性顯著下降(P<0.01)；而與對照組相比，pGL3-EIF4G2 3′UTR Mut和miR-139-5p mimic共轉(zhuǎn)染組螢光素酶活性下降不明顯(P>0.05)(圖3)。由此說明，EIF4G2是miR-139-5p的靶基因，miR-139-5p可直接結(jié)合EIF4G2 3′UTR，進(jìn)而負(fù)性調(diào)控報告基因的表達(dá)。

圖2 重組質(zhì)粒的測序

1)P<0.01圖3 螢光素酶報告實驗證實miR-139-5p靶向調(diào)控EIF4G2基因表達(dá)

3 討 論

miR-139基因位于磷酸二酯酶2A基因的第2個內(nèi)含子中，miR-139-5p是由miR 139前體所產(chǎn)生的成熟體之一。前期研究發(fā)現(xiàn)miR-139-5p在結(jié)直腸癌、肝細(xì)胞癌、胃癌、口腔鱗狀細(xì)胞癌、卵巢癌、膀胱癌等多種腫瘤中低表達(dá)，因此，通常認(rèn)為miR-139-5p屬于腫瘤抑制性miRNA〔3，11，12〕。本研究實時定量PCR結(jié)果表明，與對照組正常腦組織相比，GBM患者腦組織中miR-139-5p的相對表達(dá)水平顯著下調(diào)，提示miR-139-5p可能與GBM的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。Dai等〔6〕通過實時PCR檢測發(fā)現(xiàn)，與正常人膠質(zhì)細(xì)胞相比，miR-139-5p在多種GBM細(xì)胞系中顯著低表達(dá)，在12例GBM腦組織中也呈低表達(dá)。Li等〔7〕分析TCGA數(shù)據(jù)庫相關(guān)數(shù)據(jù)后發(fā)現(xiàn)，與正常腦組織相比，miR-139-5p在GBM腦組織中的平均表達(dá)水平顯著下調(diào)。Yuan等〔13〕結(jié)合miRStarTM腫瘤特異性miRNA芯片和實時定量PCR發(fā)現(xiàn)，與GBM短期生存患者(<450 d)相比，miR-139-5p在長期生存患者(>450 d)的表達(dá)水平顯著上調(diào)。Bo等〔14〕分析了12例原發(fā)GBM患者和12例復(fù)發(fā)GBM患者的miRNA轉(zhuǎn)錄譜，發(fā)現(xiàn)miR-139-5p在復(fù)發(fā)GBM樣本中表達(dá)下調(diào)，表明miR-139-5p的低表達(dá)可能促進(jìn)GBM復(fù)發(fā)。因此，miR-139-5p在GBM發(fā)生發(fā)展及預(yù)后轉(zhuǎn)歸等過程均發(fā)揮著功能。由于miRNAs的調(diào)控機(jī)制具有“一對多”和“多對一”的復(fù)雜特征，因此，采用生物信息學(xué)方法篩選并鑒定miRNAs靶基因，對后續(xù)具體作用機(jī)制的研究提供重要參考。本研究采用starBase工具中的TargetScan、PicTar、RNA22、PITA和miRanda多種預(yù)測工具對miR-139-5p的靶基因進(jìn)行篩選并取交集，提高了預(yù)測結(jié)果的可靠性，并結(jié)合文獻(xiàn)檢索，最后選擇EIF4G2基因作為進(jìn)一步分析的目標(biāo)。螢光素酶報告系統(tǒng)檢測結(jié)果表明，miR-139-5p可直接結(jié)合EIF4G2 3′UTR，進(jìn)而負(fù)性調(diào)控EIF4G2的表達(dá)。前期研究發(fā)現(xiàn)miR-139-5p通過抑制EIF4G2降低整體的蛋白合成，卻特異性誘導(dǎo)細(xì)胞周期抑制蛋白p27Kip1翻譯，進(jìn)而抑制CD34+造血干細(xì)胞和前體細(xì)胞的增殖，干擾粒單核細(xì)胞的分化，在髓系白血病發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用〔15〕。Dai等〔6〕研究發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87MG和T98G轉(zhuǎn)染miR-139-5p后，增殖能力下降、凋亡增加，S期細(xì)胞比例增加，G0/G1期細(xì)胞比例下降；Western印跡顯示在miR-139-5p過表達(dá)的細(xì)胞中，ELTD1蛋白水平顯著下降。因此，miR-139-5p過表達(dá)抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，可能與下調(diào)ELTD1蛋白和調(diào)節(jié)細(xì)胞周期有關(guān)。Li等〔7〕研究表明miR-139-5p在膠質(zhì)瘤中下調(diào)Mcl-1表達(dá)水平，miR-139-5p過表達(dá)能夠抑制增殖，增強(qiáng)替莫唑胺所誘導(dǎo)的凋亡。Yue等〔16〕發(fā)現(xiàn)在GBM中miR-139-5p直接靶向調(diào)控ZEB1和ZEB2轉(zhuǎn)錄因子，miR-139-5p的下調(diào)引起ZEB1和ZEB2過表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移；miR-139-5p過表達(dá)能夠抑制GBM細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移。進(jìn)一步的生物信息學(xué)分析結(jié)果表明miR-139-5p靶基因涉及多個與腫瘤發(fā)生相關(guān)的信號通路，提示其參與調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。miR-139-5p表達(dá)下調(diào)引起靶基因異常，進(jìn)而通過調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移等影響多種腫瘤的進(jìn)程，與其發(fā)生發(fā)展和預(yù)后等密切相關(guān)〔5〕。目前miR-139-5p在GBM演進(jìn)過程中的分子機(jī)制尚未闡明，相關(guān)研究值得探討。