馬紅梅 張津華 趙春水 郝彥超

(開(kāi)封市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南 開(kāi)封 475000)

動(dòng)脈粥樣硬化(AS)是指發(fā)生在大中動(dòng)脈管腔內(nèi)的慢性炎癥及纖維性增生性病變，是大部分腦血管病的病理基礎(chǔ)，具有較高的發(fā)病率、致殘率及死亡率，且發(fā)病機(jī)制較復(fù)雜〔1〕。血管內(nèi)皮細(xì)胞與血管再生、血管舒張、炎癥等血管生理學(xué)方面密切相關(guān)，有研究表明，內(nèi)皮細(xì)胞損傷是導(dǎo)致AS和高血壓的一個(gè)關(guān)鍵因素〔2〕。氧化應(yīng)激被認(rèn)為是引起內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生損傷的一個(gè)主要病理因素〔3〕。因此，尋找有效的抗氧化應(yīng)激方法對(duì)于腦血管疾病治療具有重要意義。肌細(xì)胞增強(qiáng)因子(MEF)2C是MEF2家族成員之一，有研究表明，MEF2C可通過(guò)Kruppel樣因子(KLF)2和核因子(NF)-κB抑制內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)〔4〕，在受到氧氣刺激時(shí)MEF2C可以負(fù)反饋形式抑制內(nèi)皮細(xì)胞生成〔5〕。在AS斑塊中MEF2C的表達(dá)量明顯高于其在附近血管壁處表達(dá)量，miR-499a-3p和miR-135b-5p可靶向抑制MEF2C促進(jìn)人皮膚微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HSMC)和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)增殖和遷移〔6〕。但MEF2C對(duì)AS血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制研究的尚未明確。因此，本研究使用H2O2建立血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激模型，通過(guò)RNA干擾MEF2C表達(dá)，檢測(cè)MEF2C表達(dá)受到抑制后血管內(nèi)皮細(xì)胞的活力及凋亡情況，并進(jìn)一步研究其作用機(jī)制。

1 材料方法

1.1實(shí)驗(yàn)對(duì)象 人組織標(biāo)本來(lái)源于開(kāi)封市中心醫(yī)院自2015年8月至2017年3月的AS患者斑塊，共46例，其中男21例，女25例，年齡51.3～78.3歲，平均(66.2±11.1)歲。所有患者經(jīng)血管造影確診，且嚴(yán)格排除曾經(jīng)有心絞痛、患有糖尿病及有心肌梗死病史的患者。以上患者在后期進(jìn)行腦血管手術(shù)時(shí)切除斑塊組織，同時(shí)切除部分正常血管組織作為正常對(duì)照組。組織采集后立即做好標(biāo)記，并放入液氮中保存。本研究通過(guò)開(kāi)封市中心醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)。

1.2主要試劑和儀器 Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)、胎牛血清(FBS)、噻唑藍(lán)(MTT)溶液均購(gòu)自美國(guó)Bibco；異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)細(xì)胞凋亡試劑盒、流式細(xì)胞儀均購(gòu)自美國(guó)BD；H2O2購(gòu)自美國(guó)Sigma；核因子(NF)-κB p65、NFkappaB激酶抑制劑(IKK)α、增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)、Bcl-2和GAPDH抗體均購(gòu)自美國(guó)Abcam；酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Bio Tek公司。

1.3細(xì)胞培養(yǎng) 人臍靜脈血管內(nèi)皮ECV-304細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)ATCC。細(xì)胞在含10% FBS及雙抗的DMEM培養(yǎng)基中，于37℃、5%體積分?jǐn)?shù)CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)選擇生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的細(xì)胞。

1.4siRNA轉(zhuǎn)染 MEF2C的特異性siRNA(si-MEF2C)及陰性對(duì)照組siRNA(NC)的設(shè)計(jì)參照siRNA設(shè)計(jì)原則，由上海吉瑪合成。轉(zhuǎn)染前1 d，以5×105/孔密度接種ECV-304細(xì)胞于6孔板，于37℃、5%體積分?jǐn)?shù)CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞達(dá)80%～90%融合密度時(shí)，將制備的siRNA-lip2000混合物加入至6孔板，轉(zhuǎn)染參照LipofectamineTM2000說(shuō)明，僅加脂質(zhì)體的為空白對(duì)照組，48 h后，收集細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)研究。

1.5MTT檢測(cè)細(xì)胞活力 ECV-304細(xì)胞分為3個(gè)處理組，即NC組、H2O2組和H2O2+si-MEF2C組。NC組ECV-304細(xì)胞轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照組siRNA 48 h，H2O2組ECV-304細(xì)胞先用0.5 mmol/L的H2O2刺激細(xì)胞4 h后轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照組siRNA 48 h，H2O2+si-MEF2C組先用0.5 mmol/L的H2O2刺激細(xì)胞4 h后轉(zhuǎn)染MEF2C的特異性siRNA 48 h。以5×103個(gè)/孔密度接種生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的ECV-304細(xì)胞于96孔板，常規(guī)培養(yǎng)24 h后，參照上述分組處理細(xì)胞，收集處理至規(guī)定時(shí)間的三組細(xì)胞，加MTT溶液(5 mg/ml)，每孔20 μl，37℃孵育4 h，再在每孔中加入150 μl的二甲基亞砜(DMSO)溶液，充分震蕩混勻10 min，酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值(A值，490 nm)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收集按照上述分組處理至規(guī)定時(shí)間的三組細(xì)胞，制備成單細(xì)胞懸液，收集1×106個(gè)細(xì)胞，預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌及1×結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞后，分別加入5 μl的AnnexinV-FITC 和10 μl的PI，避光環(huán)境孵育15 min，再加入1×結(jié)合緩沖液400 μl，1 h內(nèi)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)活性氧(ROS)含量 以5×104個(gè)/ml密度接種ECV-304細(xì)胞的細(xì)胞懸液于6孔板，每孔2 ml，于37℃、5%體積分?jǐn)?shù)CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h，按照上述分組處理后，加入終濃度為10 μmol/L的2′,7′-二氯熒光黃(DCF)雙乙酸鹽(DCFH-DA)工作液，避光孵育15 min，離心，收集細(xì)胞，PBS重懸細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)DCF的熒光強(qiáng)度，以此可反映出細(xì)胞的ROS水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8Western印跡檢測(cè)MEF2C表達(dá) 放射免疫沉淀法(RIPA)裂解液適量提取細(xì)胞總蛋白，二辛可寧酸(BCA)法定量蛋白樣品，每孔道上樣蛋白40 μg，經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、聚偏二氟乙烯(PVDF)轉(zhuǎn)膜、5%脫脂奶粉封閉，4℃孵育稀釋好的一抗過(guò)夜(1∶500稀釋的NF-κB p65、IKKα、PCNA、Bcl-2及內(nèi)參GAPDH抗體)，洗膜，加1∶2 000稀釋的辣根過(guò)氧化酶(HRP)標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h，電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色，顯影、定量。以目的蛋白與內(nèi)參GAPDH的灰度值比值為各蛋白的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1MEF2C在AS患者斑塊組織表達(dá) AS患者斑塊組織MEF2C蛋白表達(dá)(0.355±0.036)顯著高于正常對(duì)照組(0.047±0.008；t=14.466，P<0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 MEF2C在AS患者斑塊組織表達(dá)

2.2MEF2C siRNA轉(zhuǎn)染ECV-304細(xì)胞效果 si-MEF2C組MEF2C蛋白表達(dá)(0.071±0.009)顯著低于空白對(duì)照組(0.302±0.028)(P<0.05)，而NC組MEF2C蛋白表達(dá)(0.296±0.025)與空白對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)，三組差異顯著(F=104.720，P=0.000)，見(jiàn)圖2。

圖2 MEF2C siRNA轉(zhuǎn)染ECV-304細(xì)胞后MEF2C蛋白表達(dá)

2.3MEF2C siRNA對(duì)H2O2誘導(dǎo)的ECV-304細(xì)胞活力的影響 H2O2組細(xì)胞活力(0.417±0.038)顯著低于NC組(0.823±0.066)(P<0.05)，而H2O2+si-MEF2C組細(xì)胞活力(0.679±0.051)顯著高于H2O2組(P<0.05)。三組差異顯著(F=45.390，P=0.000)。

2.4MEF2C siRNA對(duì)H2O2誘導(dǎo)的ECV-304細(xì)胞凋亡的影響 H2O2組細(xì)胞凋亡率〔(27.11±2.08)%〕顯著高于NC組〔(3.36±0.38)%〕(P<0.05)，而H2O2+si-MEF2C組細(xì)胞凋亡率〔(11.56±0.74)%〕顯著低于H2O2組(P<0.05)。三組差異顯著(F=260.971，P=0.000)。見(jiàn)圖3。

圖3 MEF2C siRNA對(duì)H2O2誘導(dǎo)的ECV-304細(xì)胞凋亡的影響

2.5MEF2C siRNA對(duì)H2O2誘導(dǎo)的ECV-304細(xì)胞ROS水平的影響 H2O2組細(xì)胞ROS水平(2.567±0.213)顯著高于NC組(1.000±0.000)(P<0.05)，而H2O2+si-MEF2C組細(xì)胞ROS水平(1.447±0.196)顯著低于H2O2組(P<0.05)。3組差異顯著(F=69.995，P=0.000)。

2.6MEF2C siRNA對(duì)H2O2誘導(dǎo)的ECV-304細(xì)胞NF-κB信號(hào)的影響 H2O2組細(xì)胞NF-κB p65和IKKα蛋白表達(dá)顯著高于NC組，PCNA和Bcl-2的蛋白表達(dá)顯著低于NC組(P<0.05)，而H2O2+si-MEF2C組細(xì)胞NF-κB p65和IKKα蛋白表達(dá)顯著低于H2O2組，PCNA和Bcl-2的蛋白表達(dá)顯著高于H2O2組(P<0.05)。見(jiàn)圖4和表1。

圖4 MEF2C siRNA對(duì)H2O2誘導(dǎo)的ECV-304細(xì)胞NF-κB p65、IKKα、PCNA和Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

組別NF-κB p65IKKαPCNABcl-2NC組0.182±0.0200.151±0.0160.486±0.0500.243±0.024H2O2組0.803±0.0711)0.389±0.0421)0.132±0.0151)0.043±0.0071)H2O2+si-MEF2C組0.415±0.0392)0.206±0.0232)0.257±0.0262)0.192±0.0212)F/P值127.221/0.00059.128/0.00085.291/0.00091.185/0.000

與NC組比較：1)P<0.05；與H2O2組比較：2)P<0.05

3 討 論

血管內(nèi)皮病變是導(dǎo)致腦血管病發(fā)生的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、黏附因子、機(jī)械損傷等多種因素均可引起內(nèi)皮細(xì)胞損傷，其中氧化應(yīng)激是導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能障礙的一個(gè)重要因素〔7〕。H2O2是機(jī)體產(chǎn)生的ROS，是重要的自由基形成源，近些年的多項(xiàng)研究表明，H2O2可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，而血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡在AS發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用〔8，9〕。脊柱動(dòng)物中MEF2家族成員有四個(gè)，即MEF2A、MEF2B、MEF2C和MEF2D，MEF2蛋白在控制細(xì)胞增殖、凋亡、分化及多種信號(hào)傳導(dǎo)等過(guò)程中均發(fā)揮重要作用〔10〕；MEF2C可通過(guò)抑制Toll樣受體(TLR)/NF-κB信號(hào)降低AS的發(fā)展〔11〕。RNA干擾(RNAi)是由雙鏈RNA介導(dǎo)的在轉(zhuǎn)錄后阻斷基因表達(dá)的一項(xiàng)新技術(shù)，能高效性、特異性抑制目的基因表達(dá)，目前已在基因功能研究、疾病治療等多個(gè)方面廣泛應(yīng)用〔12，13〕。本研究與上述研究結(jié)果一致。將合成的特異性干擾MEF2C表達(dá)的siRNA轉(zhuǎn)染人ECV-304細(xì)胞，MEF2C的表達(dá)受到抑制，且MEF2C表達(dá)被抑制可明顯提高由H2O2引起的ECV-304細(xì)胞活力降低，并可降低細(xì)胞的凋亡率及ROS水平。提示MEF2C表達(dá)抑制可降低AS血管內(nèi)皮損傷。

NF-κB幾乎存在于所有的真核細(xì)胞中，可調(diào)節(jié)生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、黏附分子、氧化應(yīng)激相關(guān)酶等，功能涉及多種生理及病理過(guò)程〔14〕。NF-κB信號(hào)參與AS發(fā)生發(fā)展的多個(gè)環(huán)節(jié)。如枸杞多糖可通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)、減輕氧化應(yīng)激、抑制凋亡蛋白caspase-3表達(dá)等降低脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷〔15〕。蓬子菜總黃酮對(duì)氧化損傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能是通過(guò)抑制NF-κB/IκB信號(hào)途徑〔16〕。PCNA是一個(gè)在DNA合成過(guò)程中必需的核蛋白，其表達(dá)水平可反映細(xì)胞增殖，有研究表明，下調(diào)PCNA可抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖〔17，18〕。Bcl-2是一個(gè)抑凋亡蛋白，屬于Bcl-2家族成員之一，在包括AS在內(nèi)的多種腦血管疾病中可檢測(cè)到Bcl-2表達(dá)水平的降低〔19，20〕。本研究檢測(cè)NF-κB信號(hào)通路NF-κB p65和IKKα及下游與增殖凋亡相關(guān)的PCNA和Bcl-2的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)MEF2C表達(dá)抑制可降低由H2O2引起的ECV-304細(xì)胞NF-κB p65和IKKα表達(dá)升高，且上調(diào)PCNA和Bcl-2表達(dá)。這提示MEF2C對(duì)AS血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷保護(hù)與下調(diào)NF-κB 信號(hào)通路有關(guān)。

綜上，下調(diào)AS血管內(nèi)皮細(xì)胞MEF2C基因表達(dá)可提高細(xì)胞活力，抑制細(xì)胞凋亡，機(jī)制可能是細(xì)胞內(nèi)ROS水平降低及NF-κB信號(hào)通路的下調(diào)。MEF2C可能是腦血管疾病治療的一個(gè)關(guān)鍵分子，但還需更多體內(nèi)及體外的研究證實(shí)。