解光越 孫振 劉冠華 孫曉威 李世超 張志勇

(唐山市工人醫(yī)院骨科，河北 唐山 063500)

因外傷、運動性損傷、老年退變等原因?qū)е碌年P(guān)節(jié)軟骨損傷是臨床上常見的疾病。老年人群尤為常見。關(guān)節(jié)軟骨再生修復(fù)能力極其有限，一旦損傷，很難自身修復(fù)，并可進一步發(fā)展成為骨性關(guān)節(jié)炎，累及整個關(guān)節(jié)功能〔1,2〕。因此，對早期的關(guān)節(jié)軟骨損傷患者進行有效的干預(yù)治療具有重要的臨床意義。微骨折等傳統(tǒng)的治療方式均差強人意，主要以纖維軟骨修復(fù)為主，修復(fù)組織力學(xué)強度差，遠期預(yù)后差〔3〕。近些年來，軟骨組織工程技術(shù)作為一種新興的治療手段成為研究的熱門。種子細胞的選擇是軟骨組織工程重要因素之一。本研究以人臍帶Wharton膠來源間充質(zhì)干細胞(MSCs)作為種子細胞，復(fù)合藻酸鈉水凝膠(Alg)構(gòu)建組織工程軟骨，用于修復(fù)兔膝關(guān)節(jié)全層骨軟骨缺損。

1 材料和方法

1.1主要試劑與儀器 Ⅱ型膠原酶、藻酸鈉鹽、蕃紅O染液、天狼星紅染液、戊巴比妥鈉、多聚甲醛(Sigma，美國)；胰蛋白酶 、DMEM細胞培養(yǎng)液、胎牛血清 (Gibco，美國)； 高分辨率電子計算機斷層掃描(Micro-CT，GE，加拿大)。

1.2方法

1.2.1人臍帶Wharton膠來源MSCs的分離培養(yǎng) 獲取足月產(chǎn)健康產(chǎn)婦臍帶組織(患者知情，并通過唐山市工人醫(yī)院倫理委員會審核批準)，無菌條件下，磷酸鹽緩沖液(PBS)充分洗滌，去除血污等雜物。剔除動、靜脈及外膜組織，分離出Wharton膠。眼科剪剪碎至1 mm3大小顆粒，加入3倍體積濃度為0.075%的Ⅱ型膠原酶，37℃下磁力攪拌消化過夜。加胎牛血清(FBS)終止消化，離心10 min，去上清，PBS洗3遍，加入含有用含10%胎牛血清培養(yǎng)基吹打均勻后接種至培養(yǎng)瓶中，置于37℃,5% CO2培養(yǎng)箱中孵育。每2～3 d更換培養(yǎng)液。第3代(P3代)細胞用于兔膝關(guān)節(jié)全層軟骨缺損修復(fù)。

1.2.2人臍帶Wharton膠MSCs復(fù)合Alg修復(fù)兔膝關(guān)節(jié)股骨滑車骨軟骨缺損 將含有4×105/ml人臍帶Wharton膠MSCs的細胞懸液與等體積濃度為2.4%藻酸鈉溶液充分混合。向混合液中添加102mmol/L CaCl2溶液使海藻酸鈉溶液成水凝膠膠，獲得細胞終濃度為2×105/ml的人臍帶Wharton膠MSCs/Alg組織工程復(fù)合物。選取24只3月齡新西蘭大白兔，雌雄不拘(由唐山市工人醫(yī)院實驗動物中心提供，并通過醫(yī)院倫理委員會審核)。按軟骨缺損修復(fù)方式的不同，隨機均分為三組：Alg+MSCs組；Alg組；單純?nèi)睋p組。術(shù)前禁食12 h，戊巴比妥鈉誘導(dǎo)麻醉成功后，雙膝關(guān)節(jié)取外側(cè)縱切口，脫位髕骨，暴露股骨滑車，使用直徑2 mm的無菌環(huán)鉆造直徑2 mm，深1.5 mm圓柱形全層骨軟骨缺損。Alg+MSCs組軟骨缺損以人臍帶Wharton膠MSCs/Alg組織工程復(fù)合物修復(fù)；Alg組軟骨填充以單純Alg；單純?nèi)睋p組的軟骨缺損曠置作為對照。術(shù)后3個月、6個月處死實驗動物取材。

1.3檢測指標(biāo)

1.3.1Micro-CT 掃描 術(shù)后6個月處死實驗兔子，獲取膝關(guān)節(jié)，4%多聚甲醛固定24 h后置Micro-CT下掃描。三維重建軟骨修復(fù)興趣區(qū)后進行一下軟骨下骨形態(tài)學(xué)參數(shù)分析：骨體積分數(shù)(BV/TV)、骨礦物質(zhì)密度(BMD)、骨小梁數(shù)量(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)等。

1.3.2大體觀察及國際軟骨性復(fù)協(xié)會(ICRS)評分 獲取術(shù)后3個月、6個月標(biāo)本，分別由3個技術(shù)熟練的人員仔細觀察修復(fù)組織的大體表現(xiàn)，并記錄修復(fù)組織的色澤、與周圍正常軟骨整合等情況。并按照ICRS提出的評分標(biāo)準進行大體觀評分。

1.3.3病理學(xué)染色及組織學(xué)評分 術(shù)后3個月、6個月處死實驗動物，獲得膝關(guān)節(jié)，多聚甲醛固定后，石蠟包埋切片。分別進行蕃紅O染色觀察修復(fù)組織軟骨細胞外基質(zhì)沉著，天狼猩紅染色觀察修復(fù)組織的膠原成分以及膠原排列。根據(jù)Wakitani 組織學(xué)評分準則進行組織學(xué)評分。

1.3.4力學(xué)檢測 獲取術(shù)后6個月膝關(guān)節(jié)樣品，對修復(fù)軟骨進行力學(xué)檢測，分別分析硬度、折合模量、接觸剛度等參數(shù)，以正常軟骨為對照。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析及SNK檢驗。

2 結(jié) 果

2.1Micro-CT掃描 術(shù)后6個月，各組軟骨下骨均得到一定程度的重建。BV/TV、BMD、Tb.Th、Tb.N等骨形態(tài)學(xué)參數(shù)分析結(jié)果顯示，Alg+MSCs組均顯著高于Alg組和單純?nèi)睋p組(P<0.05)，見表1，表明Alg+MSCs相較其他兩組獲得更佳的軟骨下骨重建。

2.2大體觀察及評分 大體觀察顯示術(shù)后3個月，Alg+MSCs組的修復(fù)組織表面光滑，色澤紅潤，與周圍正常軟骨的界限模糊。Alg組和單純?nèi)睋p組的修復(fù)組織表面欠光滑，色澤暗淡，與周圍正常組織的界面明顯。術(shù)后6個月，Alg+MSCs組修復(fù)組織色澤與正常軟骨相近，與周圍正常組織整合良好。Alg組和單純?nèi)睋p組的修復(fù)組織粗糙，與正常軟骨存在明顯的界限。ICRS大體觀評分顯示，各個時間點Alg+MSCs組均顯著高于其他兩組(P<0.05)，見表1。

表1 術(shù)后各組軟骨下骨Micro-CT掃描參數(shù)、ICRS大體評分組織評分比較

與同時間點Alg組比較：1)P<0.05，與同時間點單純?nèi)睋p組比較：2)P<0.05，下表同

2.3病理學(xué)染色及組織學(xué)評分 蕃紅O染色結(jié)果顯示：術(shù)后3個月，Alg+MSCs組修復(fù)組織以透明軟骨為主，著色與正常軟骨組織接近，其內(nèi)可見排列較規(guī)則的透明軟骨細胞，軟骨陷窩明顯，新生軟骨與周圍正常組織整合較好。Alg組和單純?nèi)睋p組的修復(fù)組織以纖維樣組織為主，著色淺淡，其內(nèi)可見大量成纖維樣細胞，與周圍組織整合差。術(shù)后6個月Alg+MSCs組修復(fù)組織著色與正常軟骨非常接近，修復(fù)組織內(nèi)可見大量軟骨細胞及陷窩，細胞排列方式更趨向正常軟骨組織。Alg組和單純?nèi)睋p組的修復(fù)組織仍以纖維樣組織為主，與周圍正常軟骨組織存在明顯的界限(見圖1)。

N表示正常軟骨，R表示修復(fù)組織，箭頭示修復(fù)組織與正常軟骨的交界區(qū)圖1 術(shù)后6個月修復(fù)組織蕃紅O染色

天狼猩紅染色結(jié)果顯示：術(shù)后3個月，Alg+MSCs組修復(fù)組織內(nèi)富含Ⅱ型膠原，膠原排列方向較規(guī)則。Alg組和單純?nèi)睋p組的修復(fù)組織內(nèi)膠原類型主要為Ⅰ型和Ⅲ型，僅見少量Ⅰ型膠原。術(shù)后6個月，Alg+MSCs組修復(fù)組織內(nèi)可見大量Ⅱ型膠原，膠原排列方向與周圍正常軟骨組織相近。Alg組和單純?nèi)睋p組的修復(fù)組織內(nèi)仍以Ⅰ、Ⅲ型膠原為主，膠原排列雜亂無章(見圖2)。組織學(xué)評分結(jié)果顯示Alg+MSCs組各個時間點均顯著高于Alg組和單純?nèi)睋p組(見表1)。

2.4力學(xué)檢測 術(shù)后6個月，對修復(fù)組織的力學(xué)性能進行檢測，結(jié)果顯示Alg+MSCs組修復(fù)組織的硬度和折合模量均顯著高于其他兩組(P<0.05)，與正常軟骨組織相似(P>0.05)。Alg+MSCs組修復(fù)組織的接觸剛度小于正常軟骨組織(P<0.05)，但顯著高于Alg組和單純?nèi)睋p組(P<0.05)(見表2)。

N表示正常軟骨，R表示修復(fù)組織，箭頭示修復(fù)組織與正常軟骨的交界區(qū)圖2 術(shù)后6個月修復(fù)組織天狼猩紅染色

3 討 論

我國已經(jīng)進入老齡化社會，現(xiàn)65歲以上的老年人口占總?cè)丝诘?.5%，且平均老齡人口每年以3%的速度在持續(xù)增長。接近1億人以上的老年人患有骨性關(guān)節(jié)炎。骨性關(guān)節(jié)炎引起疼痛、關(guān)節(jié)攣縮、活動障礙已經(jīng)嚴重影響老年人的日常生活。骨性關(guān)節(jié)炎表現(xiàn)為關(guān)節(jié)腔局部的炎癥合并有不同程度的軟骨損傷，而常見骨性關(guān)節(jié)炎的治療策略往往單純解決炎癥問題，軟骨損傷依然存在。所以，解決老年人關(guān)節(jié)疼痛，同時控制炎癥及改善軟骨損傷尤為重要。

關(guān)節(jié)軟骨覆蓋于關(guān)節(jié)表面，具有傳遞分布負荷，減少骨端摩擦等作用。因其缺乏血管、神經(jīng)支配，再生修復(fù)能力極其有限，一旦損傷，難以繼續(xù)自身修復(fù)，這已達到國內(nèi)外學(xué)者的共識〔1，2〕。隨著關(guān)節(jié)軟骨損傷病情的進展，可累及軟骨下骨，發(fā)展成為骨性關(guān)節(jié)炎，影響整個關(guān)節(jié)，導(dǎo)致不同程度的關(guān)節(jié)功能喪失。關(guān)節(jié)炎晚期，關(guān)節(jié)置換成為無奈之舉。這不僅嚴重影響患者的生活質(zhì)量，而且給家庭和社會帶來沉重的經(jīng)濟負擔(dān)。因此，對關(guān)節(jié)軟骨損傷患者提供有效的干預(yù)治療措施具有十分重要的臨床意義。藥物對癥治療、微骨折技術(shù)等傳統(tǒng)的治療方法均未取得令人滿意的效果。組織工程作為一種新興的技術(shù)為組織再生修復(fù)提供了全新的思路和策略〔4〕。

種子細胞、支架材料、細胞因子是組織工程的三大重要因素。軟骨組織工程的基本構(gòu)思為選擇合適的種子細胞在體外擴增至足夠數(shù)量后與生物支架復(fù)合，構(gòu)建具有功能的組織工程化軟骨組織，再移植至軟骨缺損處，以期修復(fù)軟骨組織損傷。軟骨細胞是常用的種子細胞之一，臨床上自體軟骨細胞移植(ACI)技術(shù)通過在患者膝關(guān)節(jié)非負重區(qū)取一小塊軟骨，體外進行培養(yǎng)擴增后再移植至軟骨缺損處〔5〕。這種“拆東墻補西墻”的有創(chuàng)取材方式可能造成供區(qū)病變，而且軟骨細胞在平面培養(yǎng)的過程中容易去分化，從而不同程度失去分泌軟骨細胞外基質(zhì)的能力，勢必影響構(gòu)建組織工程軟骨的質(zhì)量以及后續(xù)的軟骨修復(fù)〔6〕。干細胞具有自我更新，多向分化等潛能，被作為重要的種子細胞來源。胚胎干細胞因面臨倫理，移植后致瘤等問題，應(yīng)用受到一定限制〔7〕。MSCs獲取更容易，不受倫理限制，成為研究的熱點。骨髓MSCs和脂肪肝MSCs是應(yīng)用非常廣泛的兩種干細胞類型，但也存在諸多局限。如移植至體內(nèi)后可能出現(xiàn)異位成骨，成脂等現(xiàn)象。另外隨著年齡的增長，其自我更新和多向分化能力均明顯下降〔8,9〕。因此，探索更佳的種子細胞是軟骨組織工程面臨的重要問題之一。 胎兒來源的MSCs被認為是非常有前途的種子細胞。臍帶為胚胎外組織，獲取較方便，而且不受倫理學(xué)的限制。Wharton膠為臍帶血管周圍的黏蛋白樣組織〔10〕。人臍帶MSCs(hWJMSCs)相比成人來源的MSCs具有更快的擴增速度和增殖能力，可成軟骨方向分化，致瘤性低。另外臍帶Wharton膠的細胞外基質(zhì)成分與軟骨細胞外基質(zhì)成分相似，同時hWJMSCs表達蛋白多糖，Ⅱ型膠愿等軟骨相關(guān)基因。而且hWJMSCs表達的相關(guān)生長因子、趨化因子及細胞因子的水平與軟骨細胞相仿，因此hWJMSCs被認為軟骨組織工程非常有前途的種子細胞類型〔11,12〕。本研究以hWJMSCs作為種子細胞復(fù)合藻酸鈉水凝膠構(gòu)建組織工程軟骨可有效修復(fù)兔膝關(guān)節(jié)軟骨缺損。這為軟骨組織工程種子細胞的選擇提供了新的思路，也為后續(xù)的臨床轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究提供了動物研究基礎(chǔ)。