陳文明 蹇明輝 趙然尊 石蓓

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，貴州 遵義 563099)

目前，經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療(PCI)已成為冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(冠心病，CHD)治療的重要措施之一，治療效果明顯。然而，PCI術(shù)后血管再狹窄的發(fā)生，嚴(yán)重影響患者的遠(yuǎn)期療效〔1〕。因此，如何解決PCI術(shù)后血管再狹窄的問題，已成為CHD治療的主要研究熱點(diǎn)。既往研究已證實(shí)，在PCI術(shù)后血管再狹窄發(fā)生、發(fā)展的過程中，血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)過度增殖和遷移起著非常重要的作用〔2〕，如果能有效抑制其過度增殖和遷移，那么，PCI術(shù)后再狹窄的發(fā)生率就有可能得到有效的控制。人參皂苷 Rg3是從人參中提取的一種四環(huán)三萜皂苷類化合物，具有多種藥理活性〔3〕。近年來研究表明，人參皂苷Rg3通過抑制腫瘤血管生成因子的信號傳導(dǎo)途徑，從而抑制腫瘤新生血管的形成〔4，5〕。本課題前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rg3可能通過促進(jìn)平滑肌細(xì)胞凋亡、抑制炎癥因子表達(dá)等方面減輕損傷后血管內(nèi)膜增生〔6，7〕。本文擬探討血管內(nèi)膜損傷后，人參皂苷Rg3能否通過下凋增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)的表達(dá)、抑制細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)D1和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)4的活性作用，從而減輕血管內(nèi)膜增生。

1 材料和方法

1.1主要試劑和儀器 人參皂苷Rg3，純度98%，購于上海篤瑪生物科技有限公司；Real-Time PCR試劑盒和RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于廣州市銳博生物科技有限公司；蛋白抗體PCNA、CyclinD1、CDK4和β-actin購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司；2.0 mm×12.0 mm球囊導(dǎo)管購于美國 Baxter Healthcare 公司；正置熒光電子顯微鏡購于日本Olympas 公司；PCR儀、酶標(biāo)儀和凝膠成像系統(tǒng)分析儀均購于美國BIO-RAD公司。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 SPF級健康雄性SD大鼠30只(購自重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司)，隨機(jī)分為人參皂苷Rg3(10 mg/kg)組，模型組和假手術(shù)組，每組10只。假手術(shù)組只分離左頸總動(dòng)脈，其余兩組大鼠均進(jìn)行球囊損傷。術(shù)后次日人參皂苷Rg3組開始灌胃給藥，每日1次，連續(xù)14 d。

1.3模型建立 實(shí)驗(yàn)大鼠用10%水合氯醛(3 ml/kg)經(jīng)腹腔麻醉，再腹腔注射給予肝素鈉(625 U/kg)，然后根據(jù)本課題組前期實(shí)驗(yàn)方法建立球囊損傷頸動(dòng)脈模型〔6，7〕。為了預(yù)防大鼠術(shù)后發(fā)生感染，手術(shù)結(jié)束后給予青霉素(80萬U)肌肉注射，1次/d，連續(xù)3 d。大鼠術(shù)后予普通飼料，自由飲水。

1.4蘇木精-伊紅(HE)染色 損傷血管組織用石蠟包埋，切片。經(jīng)HE染色后，用正置熒光電子顯微鏡觀察結(jié)果并拍照。拍攝結(jié)果用Image-pro Plus (IPP)圖像分析軟件測量損傷血管的內(nèi)膜厚度、中膜厚度和血管管腔面積，計(jì)算內(nèi)膜/中膜面積比。

1.5Western印跡法檢測PCNA、CyclinD1和CDK4蛋白表達(dá) 頸動(dòng)脈損傷血管組織用細(xì)胞裂解液提取總蛋白，然后用Bradford法測量樣品濃度，調(diào)節(jié)蛋白上榜濃度。蛋白經(jīng)凝膠電泳分離后用聚偏二氟乙烯(PVDF)膜轉(zhuǎn)膜，將轉(zhuǎn)好的PVDF膜放入脫脂奶粉封閉液進(jìn)行封閉。加入一抗在4℃搖床上搖動(dòng)孵育過夜，加二抗孵育1 h，加入化學(xué)發(fā)光顯色劑，用BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)曝光，分析電泳條帶灰度值，計(jì)算目的蛋白相對表達(dá)量。

1.6Real-Time PCR檢測PCNA、CyclinD1和CDK4 mRNA表達(dá) 頸動(dòng)脈損傷血管組織用 Trizol一步法提取總RNA，測定RNA的純度及濃度。采用兩步法逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：(1)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(37℃、15 min)，(2)逆轉(zhuǎn)錄酶的失活反應(yīng)(85℃、5 s)，樣本4℃冰箱保存。待確認(rèn)引物的反應(yīng)性和反應(yīng)體系(25 μl)，進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增，步驟：(1)預(yù)變性(1個(gè)循環(huán))：95℃、1 min；(2)PCR反應(yīng)(40個(gè)循環(huán))：95℃、5 s，60℃、30 s退火，延伸；(3)融解曲線：95℃、10 s，55℃、1 min。待擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，CT值采用2-△△CT法進(jìn)行分析，比較各組目的基因表達(dá)變化〔8〕。引物序列見表1。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件行t檢驗(yàn)。

表1 引物序列和擴(kuò)增產(chǎn)物長度

2 結(jié) 果

2.1人參皂苷Rg3對頸動(dòng)脈球囊損傷后血管內(nèi)膜增生的影響 顯微鏡下觀察，假手術(shù)組血管內(nèi)膜光滑，未見明顯增厚現(xiàn)象；模型組血管內(nèi)膜較假手術(shù)組明顯增加(P<0.01)，血管管腔面積減小，同時(shí)，內(nèi)膜/中膜面積比也明顯增加(P<0.01)；與模型組相比，人參皂苷Rg3組損傷血管內(nèi)膜增厚的程度明顯減輕(P<0.01)，血管管腔面積增大，內(nèi)膜/中膜面積比顯著下降(P<0.01)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義說明人參皂苷Rg3抑制球囊損傷后血管內(nèi)膜增生，見圖1、表2。

2.2人參皂苷Rg3對頸動(dòng)脈球囊損傷后血管PCNA、CyclinD1、CDK4蛋白及mRNA表達(dá)的影響 與假手術(shù)組比較，模型組損傷血管組織PCNA、CyclinD1、CDK4蛋白及mRNA表達(dá)顯著增加(均P<0.01)；與模型組比較，人參皂苷Rg3組損傷血管組織PCNA、CyclinD1及CDK4蛋白及mRNA表達(dá)明顯降低(P<0.01)，見圖2、表3。

圖1 人參皂苷Rg3 對損傷后血管內(nèi)膜形態(tài)學(xué)的影響(×100)

組別內(nèi)膜面積(mm2)中膜面積(mm2)內(nèi)膜/中膜面積比假手術(shù)組0.009±0.0010.094±0.0110.095±0.007模型組0.332±0.0311)0.108±0.0243.074±0.1631)人參皂苷Rg3組0.151±0.0362)0.104±0.0122)1.452±0.2152)

與假手術(shù)組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.01；下表同

圖2 Western印跡法檢測損傷血管組織PCNA、CyclinD1、CDK4蛋白的表達(dá)

組別蛋白PCNACyclinD1CDK4mRNAPCNACyclinD1CDK4假手術(shù)組0.152±0.0100.253±0.0210.112±0.011102.5±17.399.7.4±10.9109.8.1±16.5模型組0.996±0.0381)0.928±0.3121)0.863±0.0551)442.5±33.31)366.2±29.71)513.2±42.11)人參皂苷Rg3組0.384±0.0312)0.313±0.0192)0.377±0.0282)190.7±21.32)161.5±21.92)246.1±28.92)

3 討 論

PCI術(shù)后再狹窄的形成，主要是病變血管經(jīng)球囊擴(kuò)張后，血管內(nèi)膜遭到機(jī)械性損傷，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞脫落；同時(shí)，在球囊擴(kuò)張過程中，血管的拉伸和撕裂引起血管彈性回縮，導(dǎo)致?lián)p傷的血管局部出現(xiàn)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，甚至有血栓的形成；VSMCs過度增殖和遷移，加上細(xì)胞外基質(zhì)也不斷分泌聚集，從而引起血管內(nèi)膜不斷增厚，導(dǎo)致血管管腔狹窄〔9〕。PCNA是一種存在于細(xì)胞核內(nèi)的多聚酶的輔助蛋白，在細(xì)胞中呈周期性變化。細(xì)胞處于靜止期時(shí)，PCNA 基本不表達(dá)；細(xì)胞進(jìn)入增殖期時(shí)，細(xì)胞中PCNA 合成與表達(dá)增強(qiáng)，與DNA的合成緊密相關(guān)〔10〕。因此，將PCNA作為評價(jià)細(xì)胞增殖狀態(tài)及活性的重要有效指標(biāo)之一。本研究通過建立頸動(dòng)脈球囊損傷模型，觀察人參皂苷Rg3對血管內(nèi)膜增生的影響，結(jié)果提示人參皂苷Rg3可以抑制細(xì)胞增殖，具有減輕血管內(nèi)膜增生的作用。

CyclinD1 是G1期細(xì)胞周期素，是細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期促進(jìn)細(xì)胞分裂增殖的關(guān)鍵調(diào)控因子。CyclinD1與細(xì)胞周期依賴性激酶CDK4 結(jié)合，促進(jìn)下游的Rb蛋白的磷酸化；此時(shí)，受Rb蛋白調(diào)控的轉(zhuǎn)錄激活因子E2F被釋放，促使一些與DNA復(fù)制有關(guān)的酶蛋白基因得以表達(dá)，從而啟動(dòng)細(xì)胞DNA的復(fù)制，縮短細(xì)胞周期，導(dǎo)致細(xì)胞周期調(diào)節(jié)失控，細(xì)胞異常增殖〔11〕。近年研究發(fā)現(xiàn)，損傷血管組織中的 CyclinD1、CDK4表達(dá)率明顯高于正常的血管組織，推斷在血管再狹窄的發(fā)生發(fā)展過程中，CyclinD1、CDK4 蛋白的呈過度表達(dá)〔12，13〕。

本實(shí)驗(yàn)利用Western印跡和Red-Time PCR檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rg3可以抑制球囊損傷后頸動(dòng)脈CyclinD1、CDK4的表達(dá)，從而抑制血管新生內(nèi)膜增生。綜上所述，人參皂苷Rg3能抑制大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷后血管內(nèi)膜增生，其機(jī)制可能與下凋PCNA表達(dá)、抑制細(xì)胞周期相關(guān)蛋白CyclinD1、CDK4活性有關(guān)，但其發(fā)揮作用的具體機(jī)制尚不明確，有待深入研究。