楊必敬,汪 靖,葛 鑫,徐子昂,徐宏光

(皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 弋磯山醫(yī)院 脊柱外科,安徽 蕪湖 241001)

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是干細(xì)胞家族中重要組成成員之一，屬于多功能干細(xì)胞，具有多向分化的能力和自我復(fù)制的特點(diǎn)，研究證明MSCs在特定的環(huán)境下能夠分化成骨、軟骨、神經(jīng)、血管等不同組織的細(xì)胞[1-2]。半月板的損傷可以破壞膝關(guān)節(jié)的穩(wěn)定性并使其退變，利用間充質(zhì)干細(xì)胞的治療潛力可以恢復(fù)半月板的獨(dú)特結(jié)構(gòu)和功能，臨床上也可以減輕患者的痛苦[3-4]。一定的力學(xué)刺激在人的骨骼發(fā)育、骨質(zhì)生長(zhǎng)、骨折的損傷修復(fù)過(guò)程中起到了重要作用[5],間歇性循環(huán)張力(intermittent cyclic mechanical tension，ICMT)可以重排軟骨細(xì)胞的骨架引起細(xì)胞形態(tài)上的改變，但是短時(shí)間內(nèi)給予適當(dāng)?shù)牧W(xué)牽張可以調(diào)節(jié)鈣化相關(guān)的基因表達(dá)從而維持軟骨細(xì)胞表型和功能的穩(wěn)定[6-7]。骨性關(guān)節(jié)炎是骨科中的常見病，其主要原因就是軟骨細(xì)胞合成和分解平衡失調(diào)，導(dǎo)致軟骨不斷減少，從而發(fā)生炎癥反應(yīng)。目前臨床上缺乏有效的方法去修復(fù)軟骨細(xì)胞的缺損。本實(shí)驗(yàn)主要研究在間歇性循環(huán)張力作用下，能否促進(jìn)干細(xì)胞向軟骨方向分化，進(jìn)而為探索出有效治療骨性關(guān)節(jié)炎的新方法提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 人間充質(zhì)干細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)ScienCell公司。試劑及儀器：DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、磷酸鹽緩沖液(Gibico，美國(guó))；成人軟骨誘導(dǎo)液(賽業(yè)生物科技有限公司，中國(guó))；CCK-8試劑盒(翔博生物科技有限公司,中國(guó))；凋亡試劑盒(凱基生物技術(shù)公司，中國(guó))；番紅O染色試劑盒(索萊寶生物科技有限公司，中國(guó))；Trizol(Invitrogen，美國(guó))；Nano-Drop2000(Thermo&Scientific，美國(guó))；Real-time PCR試劑盒(Takara，日本)；RT-PCR儀(Roche LightCycler480，德國(guó))；FX-5000細(xì)胞應(yīng)變加載系統(tǒng)、BioFlexTM 六孔加力板(美國(guó)Flexcellint國(guó)際公司)。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)人間充質(zhì)干細(xì)胞 復(fù)蘇原代人間充質(zhì)干細(xì)胞，將其放入37 ℃水浴鍋快速融化，移入15 mL離心管并以10 000 r/min離心5 min，去上清，然后加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基1 mL吹打混勻，接種到10 cm培養(yǎng)皿后放入培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)(37 ℃、5%CO2)，3 d換一次液，直到細(xì)胞融合至80%～90%時(shí)按1∶2或1∶3傳代，取P2代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，待P2代細(xì)胞貼壁后加入成軟骨誘導(dǎo)液，實(shí)驗(yàn)分為加力組(10%伸長(zhǎng)率、0.5 Hz、8 h/d)和對(duì)照組(不加力相同環(huán)境下培養(yǎng))進(jìn)行細(xì)胞檢測(cè)。

1.2.2 用CCK-8試劑檢測(cè)細(xì)胞增殖 取兩組細(xì)胞，棄上清，每孔加入含100 μL CCK-8的培養(yǎng)液1 mL，放入培養(yǎng)箱孵育2 h，之后吹打混勻(注意不能產(chǎn)生氣泡)，每孔吸100 μL放入96孔板在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)量OD值，測(cè)量波長(zhǎng)為450 nm，每組設(shè)4個(gè)副孔，計(jì)算其平均OD值，繪制細(xì)胞增殖曲線。

1.2.3 用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收集兩組細(xì)胞，取1×105細(xì)胞用500 μL Binding Buffer重懸，加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC混勻，最后再加入5 μL碘化丙啶染色液混勻。室溫、避光反應(yīng)15 min,在流式細(xì)胞儀下檢測(cè)細(xì)胞染色情況，利用Flow JO軟件分析細(xì)胞凋亡情況。

1.2.4 番紅O染色檢測(cè)成軟骨情況 取兩組細(xì)胞吸去培養(yǎng)液，用PBS洗2次，再用4%的多聚甲醛固定5～6 min，PBS洗2遍，加入番紅O染色5～6 min，吸除染液PBS洗滌，晾干后觀察拍照。

1.2.5 RNA的提取及Real-time PCR 吸去六孔板中的培養(yǎng)液，用PBS洗兩次，每孔加入1 mL Trizol冰上裂解20 min提取RNA，用Nano-Drop 2000測(cè)定RNA濃度并達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求純度，按20 μL反轉(zhuǎn)錄體系反轉(zhuǎn)成cDNA后進(jìn)行RT-PCR，每個(gè)樣品均設(shè)3個(gè)副孔。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s；60 ℃退火延伸25 s，擴(kuò)增50個(gè)循環(huán)。PCR反應(yīng)引物如表1，GAPDH為內(nèi)參。使用Roche LightCycler480軟件分析結(jié)果，計(jì)算2-△△Ct值。

表1 實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)引物序列表

2 結(jié)果

2.1 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖結(jié)果 前期加力組與對(duì)照組的增殖水平大致相同，從第6天開始加力組抑制間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表2，圖1)。

表2 兩組CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖結(jié)果比較

2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況 細(xì)胞培養(yǎng)第14天，加力組細(xì)胞凋亡數(shù)(17.62±0.75)多于對(duì)照組(8.26±0.81)，t=14.786,P<0.01,說(shuō)明加力促進(jìn)細(xì)胞凋亡(圖2)。

2.3 番紅O染色檢測(cè)成軟骨結(jié)果 細(xì)胞培養(yǎng)第14天，番紅O染色加力組顏色淺于對(duì)照組(圖3)。

2.4 Real-time PCR檢測(cè)軟骨基因表達(dá)結(jié)果 第14天檢測(cè)細(xì)胞軟骨基因的表達(dá)水平，結(jié)果顯示對(duì)照組軟骨基因表達(dá)水平高于加力組，加力可以抑制ACAN、COLⅡ、SOX9的表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3和圖4。

表3 兩組Real-time PCR檢測(cè)軟骨基因表達(dá)結(jié)果

第14天加力組ACAN、COLⅡ、SOX9基因的表達(dá)水平低于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(*P<0.05)。

3 討論

軟骨細(xì)胞作為種子細(xì)胞存在來(lái)源不足、機(jī)體損傷及老化等多種問(wèn)題，而間充質(zhì)干細(xì)胞具有自我復(fù)制和多向分化的潛能[8-10]。我們可以利用間充質(zhì)干細(xì)胞這一特性，找到固定的條件使間充質(zhì)干細(xì)胞向成軟骨方向分化，解決軟骨組織工程中種子細(xì)胞來(lái)源問(wèn)題。

機(jī)械牽張力是一種能夠影響細(xì)胞功能和結(jié)構(gòu)的外界刺激，不同種類的細(xì)胞具有明顯的差異性，對(duì)相同的力學(xué)刺激所表達(dá)出的結(jié)果不同，同種類細(xì)胞對(duì)不同的力學(xué)刺激所產(chǎn)生的結(jié)果也不同[11]。研究表明適當(dāng)?shù)牧W(xué)刺激可以加速牙周韌帶干細(xì)胞的增殖和成骨分化，使產(chǎn)生破骨細(xì)胞和炎性因子的量達(dá)最低水平；過(guò)度的力學(xué)刺激則會(huì)導(dǎo)致相反的結(jié)果[12]。還有研究發(fā)現(xiàn)在沒(méi)有任何生物化學(xué)因子影響的條件下，3%左右的牽張力可以促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨方向分化，而10%的牽張力可以使其向平滑肌細(xì)胞分化[13]。大部分的研究證明，力學(xué)刺激可以影響干細(xì)胞的增殖和成骨分化，但張力對(duì)人間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨分化影響很少有文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)在10%的力學(xué)刺激作用下，通過(guò)檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞增殖，凋亡，體外成軟骨染色和軟骨基因的表達(dá)，證明了10%的力學(xué)刺激是抑制間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨分化的。當(dāng)然本文的不足之處為只研究了10%的力學(xué)刺激，其他的力學(xué)強(qiáng)度以及力學(xué)頻率還沒(méi)有去驗(yàn)證。另外，我們之所以會(huì)選擇第14天去檢測(cè)軟骨基因表型是因?yàn)榉tO染色最少要兩周才能染出軟骨基質(zhì)的顏色，我們想從同一時(shí)間點(diǎn)的軟骨染色和軟骨基因表達(dá)兩個(gè)指標(biāo)去驗(yàn)證力學(xué)刺激對(duì)軟骨分化的影響。但是兩周之前軟骨基因的表達(dá)變化我們尚不清楚，所以加力后檢測(cè)軟骨基因表達(dá)的時(shí)間可能還需要調(diào)整。

目前軟骨缺損和修復(fù)問(wèn)題面臨很大的挑戰(zhàn)，本研究發(fā)現(xiàn)間歇性循環(huán)張力作用下影響了干細(xì)胞成軟骨分化，這為臨床上治療軟骨再生問(wèn)題提供了新思路，同時(shí)也為今后骨關(guān)節(jié)炎的治療奠定了實(shí)驗(yàn)和理論基礎(chǔ)。