杜 卉，張 揚，孟祥健，呂康甲，吳曉莉，王李卓，邢春燕，何春玲，高家林

(1.皖南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院 弋磯山醫(yī)院 內分泌科,安徽 蕪湖 241001;2.皖南醫(yī)學院 a.臨床醫(yī)學院;b.生物化學與分子生物學教研室,安徽 蕪湖 241002)

自噬和凋亡是真核生物體內兩種重要的生理過程。自噬是體內物質降解的重要途徑，借助具有雙層膜結構的自噬小泡，將降解底物運送至溶酶體內降解。多種體內外刺激因素引起內環(huán)境改變，使自噬上游調控通路被激活，ULK1/ULK2復合體活化使自噬起始，隨后在Beclin1-Vps34-Vps15復合體的作用下成核，借助Atg12-Atg 5系統(tǒng)和LC3修飾這兩個泛素樣系統(tǒng)調控自噬體膜的形成和延伸，最終形成自噬體并與溶酶體融合，底物進入溶酶體內降解，形成一個完整的自噬過程。細胞內破損或衰老的細胞器、錯誤合成或錯誤折疊的蛋白質等可以通過自噬被降解，從而維持細胞內的相對穩(wěn)定。凋亡也是體內促進細胞數(shù)量相對穩(wěn)定的自我平衡機制，同時可以發(fā)揮防御功能，凋亡通過caspase家族發(fā)揮作用，通過級聯(lián)反應導致細胞核固縮、DNA斷裂和細胞核的崩解，最終形成凋亡小體被周圍細胞吞噬。自噬和凋亡參與癌癥發(fā)病[1- 2]，脂性凋亡[3]和脂質自噬[4]，在脂質誘導機體病變的過程中發(fā)揮重要作用。

棕櫚酸為飽和脂肪酸，對于脂質代謝相關疾病的發(fā)病具有重要意義，飽和脂肪酸攝入過多能夠增加心血管疾病的發(fā)病風險[5]，前期研究中發(fā)現(xiàn)脂質和自噬及凋亡有密切聯(lián)系，所以我們希望明確棕櫚酸對于自噬和凋亡的具體影響，從而進一步明確脂質與自噬和凋亡的關系，指導相關疾病的防治。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗細胞 小鼠正常肝細胞(AML12細胞)購自美國模式培養(yǎng)物集存庫(American type culture collection,ATCC)，人肝癌細胞(HepG2細胞)購自中國科學院細胞庫。棕櫚酸處理前細胞均經(jīng)過1%FBS培養(yǎng)基預處理。

1.1.2 主要材料與試劑 棕櫚酸鈉購自Sigma公司；無脂肪酸牛血清白蛋白購自生工生物公司；AML12細胞完全培養(yǎng)液(SCSP-654)購自中國科學院細胞庫；p-mTOR、Atg5、p-erk均購自Cell Signaling Technology；Bcl2購自Proteintech；LC3B、β-actin購自美國Sigma公司；P62購自Abcam公司；辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(H+L)、辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG(H+L)及DAPI染色液購自碧云天公司；化學發(fā)光底物和彩色預染蛋白質分子量標準(10～180 ku)購自賽默飛世爾科技；Cell Counting Kit-8(CCK-8)試劑盒購自北京索萊寶公司；甲醇(AR)購自國藥集團化學試劑有限公司，實驗用水均為超純水(產(chǎn)自Millipore超純水系統(tǒng))。

1.2 方法

1.2.1 藥物配制 用甲醇配制棕櫚酸鈉母液，用含1%無脂肪酸牛血清蛋白的完全培養(yǎng)液稀釋至所需濃度。

1.2.2 CCK8法檢測細胞活力 細胞接種于96孔板，37℃，5%CO2預培養(yǎng)24 h，向孔內加入10 μL不同濃度棕櫚酸溶液，培養(yǎng)箱內孵育8 h，更換新鮮培養(yǎng)基，每孔加入10 μL CCK-8溶液，在培養(yǎng)箱內孵育4 h，酶標儀測定450 nm處吸光度。

1.2.3 DAPI染色 吸棄培液，PBS漂洗1次，加入適量DAPI染色液室溫避光染色5 min，吸棄DAPI染色液，PBS清洗3次，每次5 min，在半智能熒光倒置顯微鏡下觀察。

1.2.4 western blotting 檢測蛋白水平 處理后的貼壁細胞，PBS洗滌后加入適量蛋白裂解液，將細胞收集至潔凈的1.5 mL EP管，細胞破碎儀破碎細胞后于冰上靜置30 min，隨后4℃、12 000 r/min離心15 min，上清即為細胞總蛋白。按照蛋白60 μg/孔上樣，SDS-PAGE電泳分離蛋白，轉膜，封閉，一抗4℃孵育過夜，1×TBST洗滌3次，每次10 min，二抗室溫孵育1 h，1×TBST洗滌3次，每次10 min，ECL發(fā)光法顯影。

1.2.5 統(tǒng)計學處理 利用Microsoft Excel 2007、SPSS 16.0和GraphPad Prism 5軟件處理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)分析采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 western blotting檢測棕櫚酸對細胞的影響 不同濃度的棕櫚酸溶液孵育HepG2細胞8 h,檢測自噬及凋亡相關蛋白的表達。mTOR是自噬調控蛋白，mTOR被抑制時，Atg13去磷酸化，形成ULK1-Atg13-FIP200復合物，促進吞噬泡的形成；而Atg12-Atg5-Atg16復合物和LC3Ⅱ能夠促進自噬體形成，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比例與自噬泡的數(shù)量正相關。實驗結果顯示從棕櫚酸濃度達到200 μmol/L開始，p-mTOR下降，Atg5增加，LC3Ⅱ/ LC3Ⅰ增加，表明自噬開始增強，可能由于棕櫚酸使自噬降解底物基數(shù)增加，所以P62表達也增加，與此同時，p-erk表達增加，表明棕櫚酸可能通過Erk1/2通路發(fā)揮作用,同時發(fā)現(xiàn)Bcl2在棕櫚酸處理后表達增加(圖1、表1)。

2.2 CCK-8檢測棕櫚酸對細胞活力的影響 不同濃度棕櫚酸處理細胞，CCK-8試劑盒檢測細胞活性，CCK-8可在電子載體的作用下被細胞中的脫氫酶還原為水溶性的黃色甲臜產(chǎn)物，OD值越大，則活細胞數(shù)量越多，在實驗中發(fā)現(xiàn)隨著棕櫚酸濃度增高細胞數(shù)量不斷減少(圖2)。

圖1 western blotting檢測棕櫚酸對細胞的影響

表1 棕櫚酸對細胞中自噬相關蛋白的影響

*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

圖2 不同濃度棕櫚酸對AML12細胞活力的影響

2.3 棕櫚酸處理不同時間對細胞的影響 根據(jù)圖2濃度作用曲線選取200 μmol/L的棕櫚酸作用于細胞，觀察不同作用時間對細胞的影響，結果顯示隨著作用時間延長，細胞活力不斷下降，存活細胞不斷減少(圖3)。

2.4 DAPI染色檢測棕櫚酸對細胞的影響 用200 μmol/L棕櫚酸作用于AML12細胞，DAPI染色檢測細胞核變化，結果顯示棕櫚酸處理后細胞核染色加深、變亮，提示核固縮(圖4)。

200 μmol/L的棕櫚酸分別作用于細胞0、6、8、12 h后細胞數(shù)量(20×)

A.正常培養(yǎng)的AML12細胞細胞DAPI染色(20×)；B.棕櫚酸處理后的AML12細胞DAPI染色(20×)。

3 討論

非酒精性脂肪肝病是常見的慢性疾病，流行病學研究顯示，在工業(yè)化國家中約有14%～27%的人口患有非酒精性脂肪肝病[6]，非酒精性脂肪肝病已經(jīng)成為慢性肝病最常見的原因[7]，但同時研究也表明非酒精性脂肪肝病在一定程度上是可逆的，肥胖病患者在進行減肥手術后不僅肝脂肪變能夠得到好轉[8]，肝纖維化的比例也有所下降[9]，由此可見肥胖與非酒精性脂肪肝病的發(fā)病關系密切，而肥胖人群中脂肪酸的含量，則被證明是影響脂肪肝最重要的因素[10]。脂肪酸分為飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸，而飽和脂肪酸是引起非酒精性脂肪肝病進展的重要原因，飽和脂肪酸能夠誘導JNK依賴性的肝細胞脂性凋亡[11]，明確飽和脂肪酸對機體的影響，對于進一步的疾病預防和治療具有重要意義。

許多蛋白、因子被發(fā)現(xiàn)可以通過影響自噬過程來改善或加劇NAFLD的進程[12]，有研究顯示在肝細胞中棕櫚酸能夠通過活化JNK2通路激活自噬[13]，種種研究顯示飽和脂肪酸影響NAFLD的機制和自噬與凋亡密切相關，因此，了解飽和脂肪酸影響自噬和凋亡的機制十分必要。棕櫚酸屬于飽和脂肪酸，研究棕櫚酸對于肝細胞的作用能夠很好地幫助我們了解飽和脂肪酸影響肝臟的機制。

我們檢測了HepG2細胞在不同濃度棕櫚酸作用下自噬的變化，發(fā)現(xiàn)p-mTOR下降、Atg5及 LC3Ⅱ/ LC3Ⅰ增加，說明自噬活化增加，P62增加可能是由于底物總量過多導致的。實驗結果說明棕櫚酸能夠激活自噬，但到達一定濃度后再增加棕櫚酸濃度自噬活性并不會隨之增高。Erk1/2能夠作用于mTOR繼而影響自噬，因此棕櫚酸對于自噬的影響可能是通過抑制Erk1/2通路，使p-mTOR下降，進而激活自噬下游通路而實現(xiàn)的；此外我們也發(fā)現(xiàn)Bcl2表達增加(圖1)，Bcl2一般被認為是抗凋亡蛋白，可以抑制細胞色素C的釋放，從而阻止凋亡的發(fā)生；同時，Bcl2能與Bcl2家族的促凋亡蛋白形成異二聚體保護細胞不進入凋亡程序[14]。

考慮到癌癥與凋亡的密切聯(lián)系[15]，我們選擇小鼠正常肝細胞檢測凋亡的改變。CCK-8結果顯示隨著棕櫚酸濃度升高細胞存活率不斷下降(圖2)，延長棕櫚酸作用的時間，存活細胞不斷減少(圖3)，用DAPI染色發(fā)現(xiàn)棕櫚酸處理后細胞核致密、濃染，說明細胞凋亡增加；但在前期實驗中發(fā)現(xiàn)抗凋亡蛋白Bcl2在棕櫚酸處理后增加，我們猜想可能是棕櫚酸介導的細胞凋亡并不主要由Bcl2調節(jié)。另有文獻報道Bcl2家族中促凋亡蛋白及抗凋亡蛋白的表達程度并非是決定細胞凋亡的唯一因素[16]，因此細胞凋亡的程度與Bcl2的表達量可能不完全一致?？傊?，通過實驗我們確定棕櫚酸可以促進細胞凋亡，同時通過Erk1/2信號通路途徑來激活自噬。