劉 問

(湖州師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院, 浙江省水生生物資源養(yǎng)護(hù)與開發(fā)技術(shù)研究重點實驗室, 湖州 313000)

青魚(Mylopharyngodon piceus)是我國傳統(tǒng)淡水養(yǎng)殖的“四大家魚”之一, 具有生長快、產(chǎn)量高、肉味鮮美等特點, 深受廣大消費者的喜愛。據(jù)統(tǒng)計,2017年我國養(yǎng)殖青魚年產(chǎn)量達(dá)6.32×108kg, 主產(chǎn)區(qū)為江蘇、安徽、江西、浙江、湖北等省[1]。隨著青魚養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展, 養(yǎng)殖面積不斷擴大, 集約化程度不斷提高, 養(yǎng)殖水質(zhì)易惡化, 在養(yǎng)殖過程中青魚病害頻發(fā), 其中以嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)感染引起的病害最為嚴(yán)重, 造成了較大的經(jīng)濟損失[2—6]。嗜水氣單胞菌廣泛存在于淡水、污水及土壤中, 是淡水養(yǎng)殖魚類的主要致病菌。在嗜水氣單胞菌侵入魚體后, 先在腸道內(nèi)增殖, 再經(jīng)門動脈循環(huán)進(jìn)入肝臟、腎臟及其他組織, 引起肝臟、腎臟等器官以及血液病變, 繼而出現(xiàn)全身癥狀。在我國, 嗜水氣單胞菌是危害養(yǎng)殖魚的種類最多、影響區(qū)域最廣、流行季節(jié)最長、發(fā)病率和死亡率高、造成經(jīng)濟損失最嚴(yán)重的細(xì)菌性病原[7—13], 對我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。

魚類肝臟具有分泌膽汁、排毒、儲存糖元等功能, 是機體維持生理機能最核心的器官之一。在魚體受嗜水氣單胞菌侵染后, 肝臟表現(xiàn)出不同程度的病理變化, 如腫大、充血或失血等, 顯微鏡檢可見血源性色素沉著、肝細(xì)胞腫脹、變性、壞死、崩解等癥狀。目前, 鮮見應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)方法研究嗜水氣單胞菌對魚體肝臟的分子致病機制方面的報道。本研究采用iTRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù), 通過分析嗜水氣單胞菌感染青魚前后青魚肝臟組織蛋白表達(dá)的變化, 及差異表達(dá)蛋白主要參與的生物過程及信號通路等, 探討嗜水氣單胞菌對青魚的致病機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康青魚購自浙江湖州市某養(yǎng)殖場, 平均體重為186 g, 養(yǎng)殖水溫為(26±1)℃ 。

1.2 主要儀器

Easy nLC色譜系統(tǒng)(Thermo Scientific)、Q Exactive質(zhì)譜儀(Thermo Scientific)、AKTA Purifier 100純化儀(GE Healthcare)、Multiskcan FC酶標(biāo)儀(Thermo Scientific)、低溫高速離心機(Eppendorf 5430R)、真空離心濃縮儀(Eppendorf Concentrator Plus)、MP Fastprep-24勻漿儀(MP Biomedicals)、超聲破碎儀(寧波新芝JY92-II)、Votex振蕩器(上海琪特QT-1)。

1.3 青魚感染試驗

采用致病性嗜水氣單胞菌菌株BCK0712(由本實驗室分離自發(fā)病青魚), 腹腔注射感染健康青魚,注射劑量為7.60×105cfu/g組織, 每組注射5尾青魚,對照組注射生理鹽水, 實驗水溫為26℃。在注射24h后, 采集感染組和對照組青魚肝臟, 分裝后-80℃凍存。同時對感染組和對照組的青魚進(jìn)行細(xì)菌分離和鑒定, 對其是否感染嗜水氣單胞菌進(jìn)行確認(rèn)。

1.4 蛋白質(zhì)提取及酶解

取50—100 mg肝臟組織加入1 mL SDT裂解液(4%SDS, 100 mmol/L Tris-HCl, 1 mmol/L DTT,pH7.6), 勻漿后超聲破碎, 沸水浴15min, 14000×g離心40min, 取上清。采用BCA法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。分裝樣品, -80℃凍存。

取30 μL蛋白質(zhì)溶液, 分別加入DTT至終濃度為100 mmol/L, 沸水浴5min, 冷卻至室溫。加入200 μL UA緩沖液(8 mmol/L尿素, 150 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0)混勻, 14000×g離心15min, 棄上清。加入100 μL IAA緩沖液(100 mmol/L IAA于UA), 振蕩混勻, 室溫避光反應(yīng)30min, 離心, 棄上清。加入100 μL UA緩沖液, 14000×g離心15min (重復(fù)2次)。加入100 μL 25 mmol/L NH4HCO3溶液, 14000×g離心15min (重復(fù)2次)。加入40 μL Trypsin溶液(40 μg Trypsin于40 μL 25 mmol/L NH4HCO3溶液), 振蕩1min, 37℃放置 16—18h。離心取上清, 測定OD280。

1.5 iTRAQ試劑標(biāo)記

各樣品分別取100 μg肽段, 按照AB SCIEX公司iTRAQ標(biāo)記試劑盒說明書進(jìn)行標(biāo)記。

1.6 強陽離子交換色譜分離

將每組標(biāo)記后的肽段混合, 采用AKTA Purifier 100進(jìn)行分級(A液: 10 mmol/L KH2PO4, 25% ACN,pH 3.0; B液: 10 mmol/L KH2PO4, 500 mmol/L KCl,25%ACN, pH 3.0)。進(jìn)柱后以1 mL /min的速率進(jìn)行梯度洗脫, 梯度洗脫如下: 0—22min, B液線性梯度從0—8%; 22—47min, B液線性梯度從8%—52%;47—50min, B液線性梯度從52%—100%; 50—58min, B液維持在100%; 58min以后, B液重置為0。洗脫過程中監(jiān)測214 nm的吸光度值, 將每個組分脫鹽并凍干。

1.7 質(zhì)譜分析

高效液相色譜采用納升流速的HPLC液相系統(tǒng)Easy nLC進(jìn)行分離(A液: 0.1%甲酸水溶液;B液: 0.1%甲酸乙腈水溶液, 其中乙腈為84%)。色譜柱以95%的A液平衡, 樣品上樣到上樣柱(Thermo Scientific Acclaim PepMap100, 100 μm×2 cm, nano-Viper C18), 經(jīng)過分析柱(Thermo scientific EASY column, 75 μm×10 cm, 3 μm, C18-A2)分離, 流速為300 nL/min。梯度洗脫如下: 0—50min, B液線性梯度從0—35%; 50—55min, B液線性梯度從35—100%; 55—60min, B液維持在100%。

質(zhì)譜鑒定樣品經(jīng)色譜分離后用Q-Exactive質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析。分析時長為60min, 檢測方式為正離子, 母離子掃描范圍是300—1800 m/z。一級質(zhì)譜分辨率: m/z為200時70000, AGC target為3e6, 一級最大(Maximum) IT為10ms, 掃描范圍數(shù)(number of scan ranges)為1, 動態(tài)排除(Dynamic exclusion)為40.0s。多肽和多肽碎片的質(zhì)量電荷比按以下方法采集: 每次全掃描(full scan)后采集10個碎片圖譜, 二級質(zhì)譜激活類型(MS2 Activation Type)為HCD, 隔離窗(Isolation window)為2 m/z。二級質(zhì)譜分辨率: m/z為200時17500, 微碎片圖譜數(shù)(microscans)為1, 二級Maximum IT為60ms, 規(guī)一化碰撞能量(Normalized collision energy)為30eV, 填充率(Underfill ratio)為0.1%。

1.8 數(shù)據(jù)分析

用軟件Mascot 2.2和Proteome Discoverer 1.4進(jìn)行查庫鑒定及定量分析。本實驗使用的數(shù)據(jù)庫為NCBI_Cyprinidae_420850_20161102.fasta (序列總數(shù): 420850)。搜索參數(shù)設(shè)置如下: 胰蛋白酶消化;胰酶消化最多允許2個漏切點; 一級離子質(zhì)量容差為0.002%; 二級離子質(zhì)量容差為0.1 Da; 固定修飾分別為Carbamidomethyl (C)、iTRAQ8plex (K)和TRAQ8plex (N-term); 可變修飾為Oxidation (M)和iTRAQ8plex (Y)。依據(jù)蛋白質(zhì)豐度水平, 當(dāng)差異倍數(shù)≥1.2(上調(diào))或≤0.83(下調(diào)), 且經(jīng)統(tǒng)計檢驗其P＜0.05 時, 視為差異表達(dá)蛋白質(zhì)。

1.9 生物信息學(xué)分析

采用數(shù)據(jù)庫中的注釋信息, 分析篩選出來的差異表達(dá)蛋白, 通過GO (Gene Ontology)分析數(shù)據(jù)庫(http//www.geneontology.org/)進(jìn)行GO分析, 從參與的生物過程(Biological process, BP)、分子功能(Molecular function, MF)及細(xì)胞組分(Cellular Component, CC)三個方面進(jìn)行顯著性分析。通過KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)數(shù)據(jù)庫(http//www.kegg.jp/kegg/pathway.html)分析差異表達(dá)蛋白主要參與的生化代謝途徑和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。

1.10 感染青魚的組織病理分析

取注射感染嗜水氣單胞菌BCK0712菌株24h后的青魚和對照組青魚, 解剖后取其肝臟組織, 用4% 多聚甲醛固定, 石蠟包埋后進(jìn)行切片, 以蘇木精-伊紅染色法染色, 中性樹膠包埋, 顯微鏡觀察和拍照。

2 結(jié)果

2.1 感染青魚的發(fā)病癥狀

健康青魚在注射感染嗜水氣單胞菌24h后, 出現(xiàn)了體色發(fā)黑、鰓蓋充血、鰭基充血、內(nèi)臟充血、肛門紅腫、腸腔內(nèi)有氣體、腹腔內(nèi)積有紅色腹水等癥狀(圖 1)。

2.2 差異表達(dá)蛋白統(tǒng)計

本實驗共鑒定到肽段14905個, 鑒定到蛋白數(shù)量為4475個。通過分析, 篩選到青魚肝臟組織的差異表達(dá)蛋白共計188 個, 其中表達(dá)上調(diào)的差異蛋白70 個(表 1按差異顯著性列出前21個), 表達(dá)下調(diào)的差異蛋白118個(表 2按差異顯著性列出前55個)。

表 1 在嗜水氣單胞菌感染青魚后青魚肝臟組織表達(dá)上調(diào)的差異蛋白Tab. 1 Up-regulated proteins in liver of A. hydrophila infected black carp

表 2 在嗜水氣單胞菌感染青魚后青魚肝臟組織表達(dá)下調(diào)的差異蛋白Tab. 2 Down-regulated proteins in liver of A. hydrophila infected black carp

續(xù)表 2

上調(diào)表達(dá)蛋白包括選擇性胸腺細(xì)胞相關(guān)蛋白2樣蛋白(Protein THEMIS2-like)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(Matrix metalloproteinase 9)、脯氨酸脫氫酶2(Proline dehydrogenase 2)、過氧化氫酶(Catalase)、延胡索酰乙酰乙酸水解酶(Fumarylacetoacetate hydrolase domain-containing protein 2A)、硫氧還蛋白(Thioredoxin)、α-珠蛋白(Alpha-globin)、硒代半胱氨酸裂解酶X3亞型(Selenocysteine lyase isoform X3)、β-葡萄糖苷酶(Cytosolic beta-glucosidase)、Na+/Cl-依賴性肌酸轉(zhuǎn)運蛋白樣蛋白1(Sodium- and chloride-dependent creatine transporter 1-like)、熱休克蛋白70(Heat shock protein 70)、多聚泛素C (Polyubiquitin-C)、核溶素樣蛋白TIA-1(Nucleolysin TIA-1-like)、溶酶體相關(guān)膜蛋白2(Lysosome membrane protein 2)、乙酰輔酶A合成酶(Acetyl-coenzyme A synthetase)、似60S核糖體蛋白L6(60S ribosomal protein L6-like)等。

下調(diào)表達(dá)蛋白包括α2熱穩(wěn)定性糖蛋白(Alpha-2-HS-glycoprotein)、谷氨酸脫氫酶(Glutamate dehydrogenase)、真核生物延長因子2激酶(Eukaryotic elongation factor 2 kinase-like)、補體C4-B (Complement C4-B)、視黃醇結(jié)合蛋白4(Retinol binding protein 4)、溶質(zhì)載體家族25成員38樣蛋白(Solute carrier family 25 member 38-B-like)、組織蛋白酶Z(Cathepsin Z-like)、死亡相關(guān)蛋白樣蛋白1-B X2亞型(Death-associated protein-like 1-B isoform X2)、血紅蛋白β亞單位樣蛋白(Hemoglobin subunit betalike)等。

2.3 生物信息學(xué)分析

為深入分析嗜水氣單胞菌感染對青魚肝臟組織蛋白表達(dá)的影響, 對差異表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行GO功能分析, 差異蛋白參與的“生物過程”主要集中在單組織過程(Single-organism process)、細(xì)胞內(nèi)過程(Cellular process)、代謝過程(Metabolic process)、生物學(xué)調(diào)控(Biological regulation)等; “分子功能”主要集中在結(jié)合活性(Binding)和催化活性(Catalytic activity)等; “細(xì)胞組分”主要集中在細(xì)胞(Cell)、細(xì)胞部分(CEll part)和細(xì)胞器(Organelle)等(圖 2)。

KEGG通路分析表明, 青魚肝臟組織的差異表達(dá)蛋白主要參與補體和凝血級聯(lián)反應(yīng)(Complement and coagulation cascades)、剪接體(Spliceosome)、細(xì)胞內(nèi)吞作用(Endocytosis)、氧化磷酸化(Oxidative phosphorylation)、碳代謝(Carbon metabolism)、精氨酸和脯氨酸代謝(Arginine and proline metabolism)、色氨酸代謝(Tryptophan metabolism)等通路(圖 3), 其中補體和凝血級聯(lián)反應(yīng)通路富集最為顯著(圖 4)。

2.4 差異表達(dá)蛋白的qRT-PCR驗證

選取差異表達(dá)蛋白補體C3和熱休克蛋白70(HSP70), 用qRT-PCR檢測其在mRNA水平上的變化。結(jié)果顯示, 在嗜水氣單胞菌感染青魚后, 青魚肝臟組織中補體C3基因的mRNA表達(dá)水平下調(diào),HSP70基因的mRNA表達(dá)水平上調(diào)(圖 5), 這與iTRAQ結(jié)果變化趨勢一致。

2.5 感染青魚的組織病理變化

感染嗜水氣單胞菌的青魚和健康青魚的肝臟組織切片于顯微鏡下觀察, 可見病魚肝臟組織發(fā)生了明顯的病理變化, 主要表現(xiàn)為肝細(xì)胞邊界不分明、細(xì)胞核固縮、肝板排列紊亂、有出血現(xiàn)象等(圖 6A); 而健康青魚肝臟切片顯示肝細(xì)胞多角形、排列緊密、細(xì)胞邊界明顯(圖 6B)。

3 討論

iTRAQ聯(lián)合液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)是近年發(fā)展起來的功能強大的比較蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)之一, 用于尋找差異表達(dá)蛋白, 為生理病理機制研究提供線索, 也可用于分子標(biāo)志物的篩選研究[14]。本實驗應(yīng)用iTRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù), 研究了青魚感染嗜水氣單胞菌前后肝臟組織蛋白質(zhì)表達(dá)的變化, 結(jié)果共篩選到188個差異表達(dá)蛋白, 其中70個(占37%)差異蛋白表達(dá)上調(diào), 118個(占63%)差異蛋白表達(dá)下調(diào), 表達(dá)下調(diào)的蛋白占比較高. 分析與免疫相關(guān)的差異蛋白, 上調(diào)表達(dá)蛋白有選擇性胸腺細(xì)胞相關(guān)蛋白樣蛋白、基質(zhì)金屬蛋白酶-9、熱休克蛋白70、過氧化氫酶、硫氧還蛋白等, 下調(diào)表達(dá)蛋白有補體C1、補體B/C2B、補體C3-Q1和補體C4-B等。

圖 2 青魚肝臟組織差異表達(dá)蛋白的GO功能分析Fig. 2 GO analysis of differently expressed proteins in liver of black carp

圖 3 青魚肝臟組織差異表達(dá)蛋白的KEGG通路分析(前20條)Fig. 3 KEGG pathway analysis of differently expressed proteins in liver of black carp (top 20)

圖 4 補體和凝血級聯(lián)反應(yīng)通路(差異表達(dá)蛋白以粗體標(biāo)注)Fig. 4 Schematic drawing of the pathway of coagulation and complement cascades (the bold fonts indicate differently expressed proteins)

圖 5 嗜水氣單胞菌感染青魚后青魚肝臟補體C3和Hsp70 mRNA的相對表達(dá)量Fig. 5 Relative expression of C3 and Hsp70 genes in liver of A.hydrophila infected black carp

選擇性胸腺細(xì)胞相關(guān)蛋白(THEMIS2)調(diào)控著巨噬細(xì)胞Toll樣受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞因子的產(chǎn)生,在巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[15]。青魚在受到嗜水氣單胞菌感染后, 肝臟組織THEMIS2的上調(diào)表達(dá), 提示THEMIS2可能參與了調(diào)控巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng), 從而增強機體免疫應(yīng)答, 以應(yīng)對病原體的感染。

基質(zhì)金屬蛋白酶-9 (MMP-9)屬于基質(zhì)金屬蛋白酶家族(MMPs), MMPs是一類蛋白水解酶, 可降解細(xì)胞外多種基質(zhì)成分。近年來, 隨著基礎(chǔ)研究的不斷深入, MMPs在炎癥中的作用越來越受重視.MMPs能通過多種途徑調(diào)節(jié)炎癥性反應(yīng)的進(jìn)程, 通過改變化學(xué)因子的功能和重要的促炎癥性細(xì)胞因子的生物可利用性, 從而促進(jìn)炎癥細(xì)胞募集[16]。研究表明, MMP-9主要由炎性細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞)分泌[17], 且MMP-9的過表達(dá)與炎癥初期釋放的某些炎性介質(zhì)呈正相關(guān)[18]。推測本實驗嗜水氣單胞菌感染導(dǎo)致魚體炎性介質(zhì)的釋放增加, 肝臟MMP-9表達(dá)上調(diào), 細(xì)胞外基質(zhì)和基膜的降解進(jìn)一步加重, 炎性細(xì)胞的浸潤加劇, 從而加重了炎性反應(yīng)。

熱休克蛋白(HSPs)是一類存在于所有生物體比較保守的蛋白, 在遇到外界刺激時, 能誘導(dǎo)或增強表達(dá), 以保護(hù)細(xì)胞免受損害[19]。HSP70是HSPs家族中表達(dá)最廣泛的蛋白, 具有促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成、折疊、運輸, 清除變性蛋白, 抗細(xì)胞凋亡和介導(dǎo)細(xì)胞免疫功能以及信號傳導(dǎo)因子的作用[20]。HSP70在正常細(xì)胞中水平較低, 在應(yīng)激狀態(tài)下可明顯升高。吉富羅非魚(Oreochromis niloticus)感染鏈球菌48h內(nèi),HSP70 mRNA在脾臟中表達(dá)升高, 感染24h后HSP70 mRNA表達(dá)量是正常脾臟組織的5.5倍多[21]。萬文菊等[22]用溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)感染劍尾魚(Xiphophorus helleri), 結(jié)果在感染瀕死魚脾臟內(nèi)檢測到HSP70基因強烈表達(dá)。研究表明,HSP70還是重要的抗原提呈調(diào)節(jié)因子, 可促進(jìn)T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng), 產(chǎn)生細(xì)胞因子, 加強NK細(xì)胞的殺傷作用, 以及介導(dǎo)NF-κB/IκB/IKK信號通路。青魚在感染嗜水氣單胞菌后, 肝臟HSP70的表達(dá)出現(xiàn)上調(diào), 提示青魚處于病原菌感染、肝組織損傷等病理應(yīng)激狀態(tài), 升高的HSP70可激活機體的免疫應(yīng)答反應(yīng), 調(diào)控免疫細(xì)胞因子的活性。

圖 6 感染嗜水氣單胞的青魚肝臟組織切片(200×)Fig. 6 Hispathological characteristic of liver of black carp infected with A. hydrophilia

過氧化氫酶(CAT)存在于所有已知動物的各組織中, 特別在肝臟中以高濃度存在。它能催化過氧化氫分解為分子氧和水, 清除體內(nèi)的過氧化氫, 從而使細(xì)胞免于遭受過氧化氫的毒害, 是生物防御體系的關(guān)鍵酶之一。硫氧還蛋白(Trx)是一類氧化還原調(diào)節(jié)蛋白, 可通過對細(xì)胞內(nèi)被氧化的二硫鍵的還原來修復(fù)機體的氧化損傷, 還可與其他氧化還原系統(tǒng)協(xié)調(diào)配合, 消除體內(nèi)過多的活性氧[23]。趙靜等[24]分析了齊口裂腹魚(Schizothorax prenanti)感染嗜水氣單胞菌后血清CAT活力變化, 結(jié)果顯示在感染初期, CAT活力明顯增強, 48h時達(dá)到峰值。嚴(yán)林飛等[25]研究表明, 大黃魚(Larimichthys crocea)感染鰻弧菌(Vibrio anguillarum)后肝組織中CAT基因的表達(dá)隨著時間的推移而變化明顯, 感染后12h達(dá)到最高(7.48倍)。本實驗青魚肝臟CAT和Trx的表達(dá)上調(diào),說明嗜水氣單胞菌感染可能引起機體產(chǎn)生大量活性氧自由基和過氧化氫, CAT和Trx的上調(diào)表達(dá)可清除體內(nèi)過量的活性氧, 進(jìn)而防止它們對機體細(xì)胞造成損傷。

補體系統(tǒng)是存在于血清、組織液和細(xì)胞膜表面的的一組不耐熱的經(jīng)活化后具有酶活性的蛋白質(zhì), 參與了機體的特異性和非特異性免疫, 在抗微生物防御反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)及介導(dǎo)免疫病理的損傷性反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。補體系統(tǒng)各成分通常以非活性狀態(tài)存在, 當(dāng)其被激活物質(zhì)活化之后, 才表現(xiàn)出生物學(xué)活性。目前已發(fā)現(xiàn)3條補體激活途徑:經(jīng)典途徑、替代途徑和凝集素途徑。 3條途徑起點各異, 但存在相互交叉, 并且有共同的末端通路, 即膜攻擊復(fù)合物(MAC)的形成及其溶解細(xì)胞效應(yīng)。由于魚類進(jìn)化地位的特殊性, 關(guān)于其補體系統(tǒng)的研究越來越受到眾多學(xué)者的重視。研究表明硬骨魚類存在補體激活的3條途徑, 補體的溶菌活性是硬骨魚類清除細(xì)菌的一個重要機制。 Li等[26]的研究表明遲緩愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)通過抑制補體替代途徑的活化逃避宿主的攻擊。人類某些疾病可引起總的補體含量或單一成分含量發(fā)生變化, 因此對補體水平的測定, 對疾病的診斷具有一定意義。青魚在感染嗜水氣單胞菌后, 肝臟中的補體C1、補體B/C2B、補體C3-Q1和補體C4-B均呈下調(diào)表達(dá), 這些補體成分參與了補體活化的3條激活途經(jīng)。在通路分析中, 與青魚補體和凝血級聯(lián)反應(yīng)通路相關(guān)的差異蛋白個數(shù)最多, 其中包含補體B/C2B、補體C3-Q1和補體C4-B等。以上結(jié)果提示在青魚受細(xì)菌感染后, 肝臟中的補體系統(tǒng)的活化受到了抑制, 機體對病原菌的殺滅作用降低, 免疫功能下降。

此外, 方獻(xiàn)平等[27]研究發(fā)現(xiàn)三角魴和團(tuán)頭魴對嗜水氣單胞菌的響應(yīng)蛋白質(zhì)多集中在糖類合成代謝、丙酮酸代謝、碳水化合物合成分解、轉(zhuǎn)錄翻譯和氧化還原等生物過程中, 并且這些應(yīng)答蛋白質(zhì)參與了結(jié)構(gòu)分子活性、核糖體結(jié)構(gòu)組成、維生素連接、輔酶連接、血紅素連接、氧氣轉(zhuǎn)運相關(guān)蛋白活性等分子功能. 本實驗篩選到的差異表達(dá)蛋白,除與免疫相關(guān)的蛋白外, 其他蛋白種類與三角魴和團(tuán)頭魴的響應(yīng)蛋白相似。

綜上所述, 本研究應(yīng)用iTRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),定量分析了青魚感染嗜水氣單胞菌前后肝臟蛋白質(zhì)組的表達(dá)變化, 并對差異表達(dá)蛋白在參與的生物學(xué)過程、分子功能、細(xì)胞定位以及參與的通路等進(jìn)行歸納整理, 研究結(jié)果為深入揭示嗜水氣單胞菌的分子致病機制奠定了理論基礎(chǔ)。