趙姣姣 陶 震 周素明 金 珊 王國良 周岐存

(寧波大學海洋學院生物技術教育部重點實驗室, 寧波 315211)

NF-κB廣泛存在于多細胞動物, 是一類能與免疫球蛋白特異性結合并能促進免疫相關基因表達的核轉錄因子, 該基因在進化的過程中非常保守[1, 2]。大量研究發(fā)現(xiàn)NF-κB能與細胞因子、黏附因子基因啟動子等的特定位點發(fā)生特異性結合, 進而參與這類基因轉錄的調控, 在機體的免疫應答、炎癥反應、細胞凋亡和生長發(fā)育方面發(fā)揮著重要的作用[2]。甲殼動物等低等無脊椎動物具有較為完善的先天非特異性免疫系統(tǒng), 包括屏障作用、濾過作用、細胞免疫及體液免疫等, 在受到外界病原刺激后能有效地識別和清除入侵的病原體[3]。目前在節(jié)肢動物中已經(jīng)鑒定的NF-κB家族有3 個成員, 包括Relish、Dorsal 和Dif等[4]。在果蠅中, Relish參與免疫缺陷(Immune deficiency, IMD)信號通路并介導抗革蘭氏陰性菌的免疫過程, Dorsal則主要參與Toll信號通路介導抗革蘭氏陽性菌以及真菌的免疫相關過程[5]。

三疣梭子蟹, 學名Portunus trituberculatus, 屬甲殼綱(Crustacea), 十足目(Decapoda), 梭子蟹科(Portunidae), 梭子蟹屬(Portunus), 是我國主要的海水蟹類養(yǎng)殖品種, 但是在環(huán)境污染、自身污染以及養(yǎng)殖技術等等諸多因素的影響下, 三疣梭子蟹病害的發(fā)生率逐年上升, 并制約了其養(yǎng)殖業(yè)的進一步發(fā)展, 溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)和葡萄牙假絲酵母(Candida lusitaniae)是梭子蟹肌肉乳化病的病原菌[6]。在無脊椎動物中Rel/NF-κB家族基因研究已有很多報道, 例如中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)[7]、羅氏沼蝦(Macrobrachium rosenbergii)[8]、斑節(jié)對蝦(Penaeus monodon)[9]等都有對Relish、Dorsal的研究報道, 而對三疣梭子蟹Relish、Dorsal基因的研究尚未見報道。本研究以三疣梭子蟹為對象, 通過RACE技術成功克隆了Pt-Rel以及Pt-DorcDNA全長, 并以三疣梭子蟹離體原代培養(yǎng)血細胞作為模型分析其在不同病原刺激下的表達情況, 為三疣梭子蟹抗感染免疫通路的研究提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

三疣梭子蟹購自寧波市路林市場, 選擇體色正常, 無異味, 健康無發(fā)病、大小規(guī)格相當?shù)膫€體。

1.2 三疣梭子蟹總RNA提取及cDNA第一鏈合成

抽取三疣梭子蟹血細胞利用RNA提取試劑盒Trizol (Invitrogen, Life Technologies)獲得總RNA,使用PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthseis Kit反轉錄試劑盒(TaKaRa, 寶生物)合成第一鏈cDNA, 合成的cDNA產(chǎn)物于保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 Pt-Rel、Pt-Dor基因克隆及測序

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中已知的其他甲殼動物Relish和Dorsal的保守序列設計出3′、5′ RACE特異引物(表 1), 以上述合成的第一鏈cDNA為模板使用3′以及5′ Full RACE Core Set with PrimeScriptTMRTase試劑盒(TaKaRa, 寶生物)PCR擴增Pt-Rel及Pt-Dor全序列, PCR結束后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物, 并用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收純化。

將純化的產(chǎn)物連接到pMD-18T (TaKaRa, 寶生物)載體上, 并轉化到感受態(tài)細胞DH5α (TaKaRa, 寶生物)中進行藍白斑篩選, 挑取陽性克隆PCR檢測后送上海華大基因科技有限公司測序。

1.4 生物信息學分析

將拼接后的Pt-Rel和Pt-Dor基因序列進行生物信息學分析。ORF Finder確定開放閱讀框(Open reading frame, ORF), ProtParam tool 預測氨基酸物理參數(shù), Blast分析Pt-Rel及Pt-Dor氨基酸與cDNA序列并檢測其與其他甲殼動物相似性, 使用MEGA 5.1 NJ (Neighbor-joining)法構建系統(tǒng)進化樹, Smart在線軟件預測蛋白結構功能域并分析。

1.5 Pt-Rel、Pt-Dor基因在6種組織中的表達

根據(jù)獲得的Pt-Rel和Pt-Dor基因cDNA序列和三疣梭子蟹18S序列設計引物(表 1), 取三疣梭子蟹心臟、血淋巴、鰓絲、腸道、肌肉及肝胰腺組織提取其RNA并反轉錄為cDNA作為模板, 以三疣梭子蟹18S rRNA作為內參, 實時熒光定量PCR(qRTPCR)檢測Pt-Rel和Pt-Dor基因在各組織中的表達量, 實驗數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法分析, 定量引物特異性及擴增效率均經(jīng)過電泳及溶解曲線檢驗, 通過標準曲線顯示其擴增效率符合相對定量PCR要求。

1.6 血淋巴細胞的離體培養(yǎng)及感染實驗

抗凝劑潤洗無菌注射器, 從暫養(yǎng)的三疣梭子蟹步足關節(jié)處抽取血淋巴液, 與抗凝劑1∶1混勻, 于1.5 mL離心管中, 室溫1000×g離心2min, 去上清。細胞用L15培養(yǎng)基(Hyclone, Life Technologies)漂洗1次后1000×g離心2min, 去上清。將漂洗干凈的血淋巴細胞用添加雙抗(Solarbio, 索萊寶)及胎牛血清(Gibco,Life Technologies)的L15培養(yǎng)基重懸并將細胞濃度調整至106個/mL。將細胞鋪在12孔板中并于26℃恒溫細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)4h, 待其貼壁后更換不添加雙抗的L15培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)8—10h后用于感染實驗。上述細胞分別用9×105CFU/mL的金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、2.5×105CFU l/mL的溶藻弧菌(V. alginolyticus)、7.5×104CFU/mL的假絲酵母(C. lusitaniae)感染2h、4h和6h取樣, 對照為非感染細胞, 每組設3個平行。

1.7 Pt-Rel、Pt-Dor熒光定量PCR

以上述微生物感染2h、4h、6h及對照原代培養(yǎng)血細胞提RNA并反轉錄為cDNA作為模板, 以GADPH作為內參進行熒光定量PCR, 數(shù)據(jù)仍采用2-ΔΔCt法分析。

表 1 PCR引物序列Tab. 1 Primers used for PCR

1.8 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 11.0軟件進行統(tǒng)計分析,P＜0.05表示差異顯著,P＜0.01表示差異極顯著。

2 結果

2.1 Pt-Rel和Pt-Dor序列分析

Pt-Rel和Pt-Dor經(jīng)過電子拼接分別得到3254 bp和2348 bp的cDNA序列, 其GenBank序列登錄號分別為: MF624027和MF624028。Pt-RelORF長2949 bp,編碼983個氨基酸, ProtParam預測其氨基酸理化性質, 推出分子式為C4757H7548N1404O1502S29, 分子量109 kD, 理論等電點pI 6.52;Pt-DorORF長1911 bp,編碼637個氨基酸, 氨基酸預測推出分子式為C3023H4806N846O930S30, 分子量68 kD, 理論等電點pI 8.66。

將推測的Pt-Rel、Pt-Dor氨基酸序列與已公布的其他甲殼動物的Relish和Dorsal氨基酸序列進行Blast 檢索分析, Relish分析結果顯示其與凡納濱對蝦 (Litopenaeus vannamei)相似性最低, 為68%, 與中華絨螯蟹(E. sinensis)相似性最高, 為79%, 與中國明對蝦(Fenneropenaeus chinensis)三個亞型相似性分別為72%、69%和69%, 與斑節(jié)對蝦(P. monodon)相似性為71%; Dorsal分析結果顯示其與日本囊對蝦(Marsupenaeus japonicus)相似性最低, 為73%, 與中華絨螯相似性最高, 為81%, 與中國明對蝦相似性為77%, 與凡納濱對蝦相似性為76%, 與羅氏沼蝦(M. rosenbergii)相似性為75%。用MEGA 5.1軟件構建系統(tǒng)進化樹, 結果顯示Pt-Rel、Pt-Dor主要與中華絨螯蟹等甲殼動物的Relish、Dorsal聚在同一分支, 而昆蟲類聚在另一分支, 親緣關系相對較遠(圖 1)。

Smart分析Pt-Rel、Pt-Dor蛋白結構, 結果顯示Pt-Rel和Pt-Dor蛋白均包含一個RHD及IPT結構域,此外Pt-Rel蛋白還包含四個重復的ANK錨蛋白序列和一個卷曲螺旋結構(圖 2)。

2.2 Pt-Rel、Pt-Dor組織分布

實時熒光定量技術檢測Pt-Rel和Pt-Dor基因在不同組織中的表達情況, 結果表明Pt-Rel(圖 3a)和Pt-Dor(圖 3b)在檢測的6個組織中都有表達, 但均在血淋巴細胞中表達量最高, 肌肉組織中表達量最低,其余各組織中表達量沒有顯著差異。

2.3 Pt-Rel和Pt-Dor基因表達分析

原代培養(yǎng)血淋巴細胞感染不同病原微生物后Pt-Rel基因表達結果顯示(圖 4a),C. lusitaniae感染組在2h跟對照組相比呈現(xiàn)極顯著上調表達, 在4h恢復到對照組水平, 并一直維持到6h, 而S. aureus和V.alginolyticus感染組在2h跟對照組相比無顯著變化,在4h分別呈顯著、極顯著上調表達, 在6h恢復到對照組水平;Pt-Dor基因表達結果顯示(圖 4b),C. lusitaniae感染組跟Pt-Rel基因表達情況相似, 而S. aureus和V. alginolyticus感染組在2h跟對照組相比分別呈顯著、極顯著下調表達, 在4h分別呈顯著、極顯著上調表達,S. aureus感染組在6h恢復到對照組水平,V. alginolyticus感染組在6h仍然稍有上調表達。

圖 1 三疣梭子蟹與其他物種的系統(tǒng)進化樹Fig. 1 The phylogenetic tree of Portunus trituberculatus and other species

圖 2 Pt-Rel和Pt-Dor蛋白結構域預測Fig. 2 The prediction of the domain of Pt-Rel and Pt-Dor protein

圖 3 qRT-PCR檢測Pt-Rel和Pt-Dor在三疣梭子蟹不同組織中的表達Fig. 3 The relative expression of Pt-Rel and Pt-Dor in different tissues

圖 4 原代培養(yǎng)血細胞感染病原微生物后Pt-Rel和Pt-Dor基因表達情況Fig. 4 The effects of pathogens on the expression levels of Pt-Rel and Pt-Dor gene in the cultivated original hemocytes

3 討論

3.1 Pt-Rel和Pt-Dor蛋白結構

果蠅Relish蛋白結構是在N端有高度保守的RHD結構, 其中包含DNA結合位點, 二聚化位點以及核定位信號等位點, 在C端則具有數(shù)個ANK錨蛋白重復序列, 但是完整的Relish在合成后不具備轉錄激活作用, 只有在切除掉 ANK結構后才能激活其轉錄因子[10, 11]。通過蛋白結構預測分析Pt-Rel蛋白具有RHD 結構及C端的數(shù)個ANK錨蛋白重復序列, 與經(jīng)典的Rel/NF-κB 家族蛋白中的Relish蛋白結構相同。果蠅 Dorsal蛋白N端與經(jīng)典的Relish蛋白N端結構相似, 均具有RHD 結構域, 但Dorsal蛋白在C端不含有重復ANK序列, 只包含一個氨基酸一級結構上并不保守的轉錄激活域(TD)[10, 12]。根據(jù)本研究克隆所得Pt-DorcDNA序列預測Pt-Dor蛋白結構在N端具有RHD結構域與經(jīng)典的Rel/NF-κB家族蛋白中的Dorsal蛋白相似; 但其C端有所不同, 表現(xiàn)在Pt-Dor較經(jīng)典的Dorsal蛋白結構短, 似乎不具有C端的轉錄激活域。類似的結構在其他甲殼動物中也有發(fā)現(xiàn), 比如中國明對蝦[9]的Dorsal蛋白結構也是如此, 推測這種 Dorsal的形式可能是由于可變剪切造成的。通過序列同源比對分析結果發(fā)現(xiàn)Pt-Rel和Pt-Dor與其他幾種節(jié)肢動物的Relish、Dorsal有很高的同源性, 其中Pt-Rel和Pt-Dor蛋白均與中華絨螯蟹Relish、Dorsal相似性最高, 分別為79%和81%, 與其他甲殼動物如中國明對蝦、凡納濱對蝦、斑節(jié)對蝦以及羅氏沼蝦等也具有很高的相似性, 進化分析也顯示上述兩個基因均與甲殼類動物聚為一支, 而昆蟲類則聚為另一支, 該結果說明甲殼類與昆蟲類的Relish和Dorsal在特征結構上存在一定的差異。

3.2 Pt-Rel和Pt-Dor組織分布

組織分布結果顯示,Pt-Rel和Pt-Dor基因在三疣梭子蟹不同組織包括心臟、血淋巴、鰓絲、腸、肌肉及肝胰腺等均有表達, 但表達豐度有所不同。Pt-Rel和Pt-Dor基因均在血淋巴細胞中表達量最高, 而在肌肉組織中表達最低。該結果與中國明對蝦[4, 10]以及羅氏沼蝦[8]組織分布結果相似。血淋巴細胞是蝦蟹類動物重要的免疫細胞, 一旦激活可以通過吞噬、包囊、結節(jié)形成及抗菌肽等免疫活性因子的釋放來清除進入體內的異物[3]。中國明對蝦Relish和Dorsal基因[4, 10]以及羅氏沼蝦Relish基因[8]在血淋巴細胞中的高表達均顯示其參與了機體的免疫反應過程, 因此Pt-Rel和Pt-Dor基因在血淋巴細胞中的高表達跟其他物種的Rel/NF-κB家族蛋白功能相似并很有可能參與了三疣梭子蟹的免疫反應。

3.3 Pt-Rel和Pt-Dor功能研究

目前在節(jié)肢動物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有3條抗感染免疫相關的信號通路, 包括Toll、IMD 和JNK通路。在黑腹果蠅中, Relish主要參與IMD信號途徑并介導抗革蘭氏陰性細菌的免疫反應, 而Dif和Dorsal則主要參與Toll信號通路并介導抗革蘭氏陽性細菌及真菌的免疫應答[12]。在甲殼動物中, 中國明對蝦Relish基因表達量在Vibrio(G-)感染后1h顯著上升, 而Micrococcus(G+)的感染在6h才使其顯著表達, 暗示中國明對蝦Relish基因在抗革蘭氏陰性菌更為重要[10]。中華絨螯蟹Dorsal基因在脂多糖(LPS, 來自革蘭氏陰性菌)、葡聚糖(GLU, 來自真菌)以及肽聚糖(PG, 來自革蘭氏陽性菌)的分別刺激下, 分別在2h、6h和12h呈顯著上調表達[7], 該結果似乎表明Dorsal基因被激活后的表達差異取決于其所感染的病原體, 即Dorsal基因在某些革蘭氏陰性菌的刺激下也能表達, 不僅僅只局限于真菌和革蘭氏陽性菌[7]。為初步研究并探討Pt-Rel和Pt-Dor的功能, 我們以三疣梭子蟹原代培養(yǎng)血淋巴細胞為模型, 利用實時熒光定量技術分析Pt-Rel和Pt-Dor基因在不同病原微生物包括S. aureus(G+)、V. alginolyticus(G-)及C. lusitaniae(真菌)感染后的表達情況。研究結果發(fā)現(xiàn),Pt-Rel和Pt-Dor基因在受到不同微生物感染時其表達模式極其相似, 特別是2個基因的表達在病原酵母菌感染早期(2h)顯著上調(Pt-Rel約上調7.5倍,Pt-Dor約上調5.5倍); 另外,V. alginolyticus(G-)感染4h 也極其明顯誘導了Pt-Rel和Pt-Dor的表達(Pt-Rel約上調6倍,Pt-Dor約上調2.5倍)。該結果表明,Pt-Rel和Pt-Dor有可能參與三疣梭子蟹抗病原酵母菌及弧菌的免疫應答。