李聞新，部 實(shí)，張 余，劉 丹，張福林

0 引言

磺丁基醚-β-環(huán)糊精(SBE-β-CD)是一種高水溶性的β-環(huán)糊精(β-CD)衍生物，能與藥物形成非共價(jià)鍵包合物，從而提高藥物的溶解性、穩(wěn)定性、安全性和生物利用度，并能掩蓋藥物的不良?xì)馕禰1-2]。與β-CD相比，其具有更好的水溶性，且溶血作用小、腎毒性低，是一種應(yīng)用前景非常廣闊的新型藥用輔料[3-4]。SBE-β-CD是由1，4-丁烷磺內(nèi)酯(1，4-BS)在堿性條件下與β-CD的2，3，6位碳上的羥基發(fā)生取代反應(yīng)得到的[5-6]。由于β-CD是由7個吡喃葡萄糖通過α-(1、4)糖苷鍵連接而成，有21個可能發(fā)生取代反應(yīng)的位點(diǎn)，因此，通過該反應(yīng)所得到的產(chǎn)物是非常復(fù)雜的混合物。20世紀(jì)90年代，美國Cydex公司開發(fā)出了取代度(Degree of substitution，DS)為7的SBE7-β-CD，商品名為Captisol。而我國起步較晚，仍處于研發(fā)階段，尚沒有商品上市。

1 材料與方法

1.1 試藥 乙腈(色譜純，F(xiàn)isher Scientific)；甲醇(色譜純，F(xiàn)isher Scientific)；乙酸(色譜純，Dikma公司)；硝酸鉀(分析純，天津市瑞金特化學(xué)品有限公司)；水為超純水；SBE7-β-CD對照品為USP標(biāo)準(zhǔn)品；SBE7-β-CD(批號：20131101、20131102、20131103、20131104、20131105、20131106，唐山市第二醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供)；4-羥基丁磺酸鈉和二磺烷基化醚鈉(唐山市第二醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供)；β-CD對照品(中國藥品生物制品檢定所)；1,4-丁烷磺內(nèi)酯對照品(美國Sigma-Aldrich公司)。

1.2 儀器 高效液相色譜儀(1260 Infinity，Agilent Technologies)，配有四元泵、在線脫氣機(jī)，示差折光檢測器(1260 Infinity，Agilent Technologies)；KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)；Milli-Q型超純水系統(tǒng)(Millipore公司)；FiveEasy型pH計(jì)(Mettler Toledo)；FRESCO21型冷凍微量離心機(jī)(Thermo Scientific)；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)。

1.3 色譜條件 色譜柱：Phenomenex PolySep-GFC-P3000(7.8 mm×30 cm)凝膠柱；柱溫35 ℃；檢測器溫度35 ℃；流動相：乙腈-0.1 mol/L硝酸鉀水溶液(35∶65)；流速1.0 ml/min；進(jìn)樣量10 μl。

1.4 溶液的配制

1.4.1 對照品儲備液 取SBE7-β-CD對照品約75 mg，精密稱定，置50 ml量瓶中，用流動相溶解、定容，得1.5 mg/ml的對照品儲備液。

1.4.2 供試品溶液 取SBE7-β-CD供試品約10 mg，精密稱定，置10 ml量瓶中，用流動相溶解、定容，得1.0 mg/ml的供試品溶液。取1 ml供試品溶液在14 000 r/min、20 ℃下離心10 min，取上清液進(jìn)樣。

1.4.3 空白溶劑及雜質(zhì)溶液 空白溶劑：流動相即為空白溶劑。雜質(zhì)溶液：分別取4-羥基丁磺酸鈉、二磺烷基化醚鈉、β-環(huán)糊精各約1 mg，并取少量1,4-丁烷磺內(nèi)酯，分別置于2 ml離心管中，用流動相稀釋至1.0 mg/ml，分別量取0.3 ml，用流動相稀釋至0.3 mg/ml，即得各雜質(zhì)溶液。供試品與各雜質(zhì)的混合溶液：分別量取1.0 mg/ml的4-羥基丁磺酸鈉、二磺烷基化醚鈉、β-環(huán)糊精雜質(zhì)溶液各0.25 ml，混合，再加入少量1,4-丁烷磺內(nèi)酯溶液和SBE7-β-CD供試品1 mg，用流動相稀釋至1 ml，混勻，即得。所有溶液需在14 000 r/min、20 ℃下離心10 min，取上清液進(jìn)樣。

1.5 方法學(xué)驗(yàn)證

1.5.1 專屬性 按“1.4.3”項(xiàng)下方法配制空白溶劑、4-羥基丁磺酸鈉、二磺烷基化醚鈉、β-環(huán)糊精、1,4-丁烷磺內(nèi)酯、SBE7-β-CD對照品溶液及SBE7-β-CD供試品與雜質(zhì)的混合溶液，按“1.3”項(xiàng)下方法分別進(jìn)樣，記錄色譜圖。

1.5.2 檢測限和定量限 取SBE7-β-CD對照品儲備液并逐級稀釋，進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，分別以信噪比S/N=3和S/N=10時(shí)各對照品的量為檢測限和定量限。

1.5.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線 取SBE7-β-CD對照品儲備液并逐級稀釋成1.4、1.2、1.0、0.9、0.7、0.5 mg/ml的對照品溶液，分別進(jìn)樣，記錄色譜圖和峰面積，以峰面積(Y)對濃度(X)進(jìn)行線性回歸。

1.5.4 精密度和準(zhǔn)確度 取20131103批供試品，平行配制6份1.0 mg/ml的供試品溶液，分別進(jìn)樣分析，記錄色譜圖和峰面積，計(jì)算含量測定結(jié)果的RSD?；厥章拾慈缦鹿接?jì)算：測得量/平均值×100%，計(jì)算6份供試品的回收率。

1.5.5 溶液穩(wěn)定性 取供試品溶液，分別在室溫下放置0、2、4、8 h進(jìn)樣分析，記錄色譜圖和峰面積。

1.6 含量測定 取各批次供試品，制備供試品溶液，進(jìn)行測定，記錄色譜圖和峰面積，以標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算供試品的含量。

2 結(jié)果

2.1 方法學(xué)驗(yàn)證

2.1.1 專屬性 SBE7-β-CD、二磺烷基化醚鈉、4-羥基丁磺酸鈉、β-環(huán)糊精、1,4-丁烷磺內(nèi)酯的保留時(shí)間分別為6.850、7.709、8.040、8.580、11.326 min，SBE7-β-CD與各雜質(zhì)峰的分離度均不小于1.94，且空白溶劑無干擾，表明該方法專屬性良好。見圖1。

圖1 專屬性色譜圖

注：a.空白溶劑，b.β-環(huán)糊精，c.4-羥基丁磺酸鈉，d.二磺烷基化醚鈉，e.1,4-丁烷磺內(nèi)酯，f.對照品，g.樣品和雜質(zhì)的混合溶液

2.1.2 檢測限和定量限 SBE7-β-CD的檢測限和定量限分別為0.32 μg和0.48 μg。見圖2、圖3。

圖2 SBE7-β-CD檢測限色譜圖

圖3 SBE7-β-CD定量限色譜圖

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線 SBE7-β-CD的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y=73 156 X-841.92，r=0.999 8，所得結(jié)果見表1。表明SBE7-β-CD在0.498 5～1.495 mg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 SBE7-β-CD的線性范圍

2.1.4 精密度和準(zhǔn)確度 6份供試品溶液含量測定結(jié)果的RSD為1.4%，表明該方法的精密度良好?；厥章蕿?7.8%～101.2%，表明該方法的準(zhǔn)確度良好。見表2。

表2 SBE7-β-CD回收率和精密度測定結(jié)果

2.1.5 溶液穩(wěn)定性 同一份供試品溶液在室溫下放置0、2、4、8 h時(shí)進(jìn)樣分析，與放置0 h相比，供試品濃度的相對誤差(RE)為-0.4%～4.9%，表明供試品溶液在8 h內(nèi)基本穩(wěn)定。見表3。

表3 SBE7-β-CD溶液穩(wěn)定性測定結(jié)果

2.2 含量測定 6批供試品的含量在95.8%～99.3%。見表4。

表4 含量測定結(jié)果

3 討論

3.1 硝酸鉀對色譜峰形的影響 本實(shí)驗(yàn)比較了流動相中不加硝酸鉀、加0.1 mol/L硝酸鉀、加0.2 mol/L硝酸鉀對色譜峰的影響，見圖4。由圖4可知，向流動相中添加硝酸鉀可以明顯改善色譜峰前延的情況，但隨著加入硝酸鉀量的增大(>0.1 mol/L)，色譜峰形的改善并不明顯，因此，本實(shí)驗(yàn)選擇0.1 mol/L的硝酸鉀。

圖4 硝酸鉀對色譜峰形的影響

注：a.乙腈-水(20∶80)，流速：0.65 ml/min；b.乙腈-0.1 mol/L硝酸鉀水溶液(20∶80)，流速：0.7 ml/min；c.乙腈-0.2 mol/L硝酸鉀水溶液(20∶80)，流速：1.0 ml/min

3.2 乙酸對分離的影響 由于4-羥基丁磺酸鈉(M=176.17)、二磺烷基化醚鈉(M=334.32)均為負(fù)離子鈉鹽，而Phenomenex PolySep-GFC-P3000凝膠柱的填料本身帶有負(fù)電荷[2]，因此這兩種雜質(zhì)最先出峰。所以嘗試加入酸，使其轉(zhuǎn)化為酸的形式，延長保留時(shí)間，從而改善分離。本實(shí)驗(yàn)考察、比較了在乙腈-0.1 mol/L硝酸鉀水溶液(20∶80)流動相中加入0.5%的乙酸與不加乙酸的效果。結(jié)果顯示，兩種條件下主峰與相鄰雜質(zhì)峰的出峰時(shí)間之差分別為0.773 min和0.771 min，見圖5。表明乙酸對分離的影響不大。因此，選擇不向流動相中添加乙酸。

圖5 乙酸對分離的影響

注：a.乙腈-0.1 mol/L硝酸鉀水溶液(20∶80)，流速：1.0 ml/min；b.乙腈-0.1 mol/L硝酸鉀溶液(0.5%乙酸)(20∶80)，流速：1.0 ml/min

3.3 有機(jī)相體系的考察 甲醇體系：本實(shí)驗(yàn)比較了甲醇-0.1 mol/L硝酸鉀水溶液(20∶80)(流速0.7 ml/min)和甲醇-0.1 mol/L硝酸鉀水溶液(35∶65)(流速0.7 ml/min)兩種流動相對分離的影響。結(jié)果顯示，兩種流動相對分離的影響不大，且分離效果不理想，見圖6?？紤]到甲醇-水混合溶液在50∶50比例時(shí)黏度較大，使柱壓增高，可能超過凝膠柱的使用范圍，故放棄使用甲醇-水作流動相。

圖6 不同比例的甲醇對分離的影響

注：a.甲醇-0.1 mol/L硝酸鉀水溶液(20∶80)，流速：0.7 ml/min；b.甲醇-0.1 mol/L硝酸鉀水溶液(35∶65)，流速：0.7 ml/min

乙腈體系：本實(shí)驗(yàn)比較了乙腈-0.1 mol/L硝酸鉀水溶液(20∶80)(流速1.0 ml/min)和乙腈-0.1 mol/L硝酸鉀水溶液(35∶65)(流速1.0 ml/min)兩種流動相對分離的影響。結(jié)果顯示，主峰與相鄰雜質(zhì)峰的分離度分別為2.12和1.94，均>1.5，且后者條件下整體出峰時(shí)間較早，見圖7。在能達(dá)到分離目的前提下，選擇乙腈-0.1 mol/L硝酸鉀水溶液(35∶65)作為流動相。

圖7 不同比例的乙腈對分離的影響

注：a.乙腈-0.1 mol/L硝酸鉀水溶液(20∶80)，流速：1.0 ml/min；b.乙腈-0.1 mol/L硝酸鉀水溶液(35∶65)，流速：1.0 ml/min

3.4 流速的考察 本實(shí)驗(yàn)考察了在乙腈-0.1 mol/L硝酸鉀水溶液(20∶80)條件下，流速分別為0.7 ml/min和1.0 ml/min時(shí)的分離情況。結(jié)果顯示，流速為1.0 ml/min條件下能明顯縮短分析時(shí)間，且對分離影響不大，見圖8。因此，本實(shí)驗(yàn)選定流速為1.0 ml/min。

圖8 流速對分離的影響

注：a.乙腈-0.1 mol/L硝酸鉀水溶液(20∶80)，流速：0.7 ml/min；b.乙腈-0.1 mol/L硝酸鉀水溶液(20∶80)，流速：1.0 ml/min

4 小結(jié)

本實(shí)驗(yàn)通過優(yōu)化色譜條件，建立了SBE7-β-CD的含量測定方法。該方法簡便、準(zhǔn)確、快捷，為SBE7-β-CD質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)的建立奠定了基礎(chǔ)。