周 嬌，張小喬，戴紅偉

0 引言

系統(tǒng)性紅斑狼瘡是一類細(xì)胞免疫和體液免疫異常的全身多系統(tǒng)受累的自身免疫性疾病，自身免疫調(diào)節(jié)功能紊亂是其主要病因，表現(xiàn)為自身反應(yīng)性T細(xì)胞大量增生和B細(xì)胞功能亢進(jìn)，細(xì)胞因子表達(dá)異常、自身抗體產(chǎn)生和免疫復(fù)合物清除障礙而引起機(jī)體多個(gè)器官損傷[1]。有研究發(fā)現(xiàn)，系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者Th及Tc細(xì)胞亞群失衡，這種自身免疫調(diào)節(jié)功能紊亂與Tc1、Tc2細(xì)胞漂移有關(guān)[2-3]。在對(duì)正常健康人群流行病學(xué)調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，Tc1和Th1細(xì)胞百分比、Th1/Th2比值和Tc1/Tc2比值均顯著低于系統(tǒng)性紅斑狼瘡活動(dòng)期患者，這進(jìn)一步證實(shí)T細(xì)胞漂移及細(xì)胞因子改變是系統(tǒng)性紅斑狼瘡發(fā)病的重要機(jī)制[4-5]。鑒于此，研究藥物對(duì)T細(xì)胞漂移及細(xì)胞因子的影響有助于該病的治療。本實(shí)驗(yàn)通過Pristane腹腔注射誘導(dǎo)BALB/c裸鼠系統(tǒng)性紅斑狼瘡動(dòng)物模型，再用雷公藤多苷灌服的方法觀察其對(duì)該模型鼠外周血T細(xì)胞漂移及細(xì)胞因子的影響，分析雷公藤多苷調(diào)控與系統(tǒng)性紅斑狼瘡發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)的T細(xì)胞漂移過程，為臨床治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物與分組 雌性清潔級(jí)BALB/c裸鼠24只，體重(26.5±1.0)g，購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，質(zhì)量合格證：SCXK(鄂)2018-001，在隨州醫(yī)院動(dòng)物中心標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室完成實(shí)驗(yàn)，設(shè)施合格證編號(hào)：SYXK(鄂)2018-001。遵循3R原則，保證動(dòng)物福利，造模前1周放空氣層流柜中無(wú)菌飼養(yǎng)，飼料和飲用水滅菌處理，飼料中加入紅霉素。動(dòng)物用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)均分為模型組、0.25 mg/(kg·d)組、0.5 mg/(kg·d)組和1 mg/(kg·d)組，每組6只。

1.2 儀器及試劑 雷公藤多苷片(廣東華南藥業(yè)集團(tuán)有限公司，Z44023753)；Pristane注射液(Sigma,批號(hào):RNBB4308V)；RPMI 1640培養(yǎng)液購(gòu)于Gibco公司(美國(guó))；淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)于上海試劑廠；流式細(xì)胞儀購(gòu)于PaTec公司(德國(guó))；CIMFITC、CD3TRI-COLOR、CD4TRI-COLOR和CD8R-PE均購(gòu)于Cahag公司(美國(guó))；CD4+-FITC、CD8+-PE-CY-5購(gòu)于Bection Dickinson公司(美國(guó))。

1.3 造模和干預(yù) Pristane誘發(fā)Balb/c裸鼠系統(tǒng)性紅斑狼瘡造模方法參照文獻(xiàn)[6]，將裸鼠24只單次腹腔注射0.5 ml Pristane，3個(gè)月后可建立穩(wěn)定的系統(tǒng)性紅斑狼瘡動(dòng)物模型。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物干預(yù)性用藥根據(jù)人與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用藥換算公式計(jì)算，治療組雷公藤多苷用藥量分別為0.25、0.5、1 mg/(kg·d)。模型組按1 ml/鼠灌服0.9%生理鹽水對(duì)照。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Th1/Th2、Tc1/Tc2淋巴細(xì)胞亞群分類及細(xì)胞因子 分別于治療前、治療3個(gè)月和6個(gè)月從尾靜脈采血，采用直接熒光標(biāo)記的流式細(xì)胞術(shù)檢查治療不同階段Th1/Th2、Tc1/Tc2淋巴細(xì)胞亞群分類。檢測(cè)時(shí)先將外周血制備成PBMNC懸液，然后取75 μl加入300 μl的無(wú)小牛血清的RPMI 1640液中，再分別加入Ionomycin液10 μl，BFA液14 μl，PMA液46 μl混勻，置于通有5%CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 h。取標(biāo)記為A1、A2、A3、A4的流式細(xì)胞儀試管4只，各加入100 μl孵育好的上述培養(yǎng)液。A1、A2、A3、A4流式細(xì)胞儀試管中加入Reagan A固定液50 μl，混勻后避光、室溫下二次孵育。孵育20 min后，每支試管中加入PBS 2 ml，混勻后離心(離心力：1 000×g，5 min)，棄上清，分別加入Reagan B 50 μl混勻，避光、室溫下孵育。孵育20 min后向管中加入PBS 2 ml，混勻后離心(離心力：1 000×g，5 min)，棄上清。每管中分別加入相應(yīng)抗體10 μl(A1:Anti-IFN-γ-PE,A2:Anti-IL-2-PE,A3:Anti-IL-4-PE,A4:Anti-IL-10-PE)，混勻后避光、室溫下孵育。孵育20 min后，再次向A1、A2、A3、A4管中加入PBS 2 ml，混勻后離心(離心力：1 000×g，5 min)，棄上清，加1 ml PBS重懸細(xì)胞，然后上機(jī)檢測(cè)外周血Th1/Th2、Tc1/Tc2淋巴細(xì)胞亞群分類及細(xì)胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10的含量。

2 結(jié)果

2.1 Tc淋巴細(xì)胞亞群分類及比值變化 模型組Tc1、Tc2百分比和Tc1/Tc2比值在治療1個(gè)月和3個(gè)月時(shí)與同組治療前比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。0.25 mg/(kg·d)組治療3個(gè)月時(shí)Tc2細(xì)胞百分比較治療前、模型組同期和治療1個(gè)月時(shí)明顯升高(P<0.05)，而Tc1百分比和Tc1/Tc2比值降低(P<0.05)。0.5 mg/(kg·d)組和1 mg/(kg·d)組在治療1個(gè)月和3個(gè)月時(shí)Tc1百分比和Tc1/Tc2比值較治療前和模型組同期明顯降低(P<0.05)，而Tc2細(xì)胞百分比明顯升高(P<0.05)。且0.5 mg/(kg·d)組與0.25 mg/(kg·d)組同期比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，1 mg/(kg·d)組與0.25 mg/(kg·d)組和0.5 mg/(kg·d)組同期比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

2.2 治療不同階段IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10含量變化比較 模型組IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10治療前后無(wú)明顯變化，治療1個(gè)月和3個(gè)月時(shí)與治療前比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。0.25 mg/(kg·d)組在治療3個(gè)月時(shí)較治療前、模型組同期和治療1個(gè)月時(shí)明顯降低(P<0.05)，但I(xiàn)L-4、IL-10明顯升高(P<0.05)。0.5 mg/(kg·d)組和1 mg/(kg·d)組IFN-γ、IL-2在治療1個(gè)月和3個(gè)月時(shí)較治療前和模型組同期明顯降低(P<0.05)，IL-4、IL-10明顯升高(P<0.05)，且0.25 mg/(kg·d)組、0.5 mg/(kg·d)組、1 mg/(kg·d)組組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表1 治療前和治療1個(gè)月、3個(gè)月時(shí)Tc淋巴細(xì)胞亞群分類及比值比較(n=6，%)

注：與模型組比較，*P<0.05；與治療前比較，#P<0.05；與0.25 mg/(kg·d)組比較，△P<0.05；與0.5 mg/(kg·d)組比較，▽P<0.05

2.3 Tc淋巴細(xì)胞亞群分類及比值變化比較 模型組Th1、Th2百分比和Th1/Th2比值治療1個(gè)月和3個(gè)月時(shí)與同組治療前比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。0.25 mg/(kg·d)組治療3個(gè)月時(shí)Th2細(xì)胞百分比升高、Th1百分比和Th1/Th2比值較治療前、模型組同期和治療1個(gè)月時(shí)降低(P<0.05)。0.5 mg/(kg·d)組和1 mg/(kg·d)組在治療1個(gè)月和3個(gè)月時(shí)Th1百分比和Th1/Th2比值較治療前、模型組同期和治療1個(gè)月時(shí)降低，Th2細(xì)胞百分比升高(P<0.05)。且0.5 mg/(kg·d)組與0.25 mg/(kg·d)組同期比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，1 mg/(kg·d)組與0.25 mg/(kg·d)組和0.5 mg/(kg·d)組同期比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

3 討論

系統(tǒng)性紅斑狼瘡是以女性多發(fā)的具有性別偏好性的自身免疫功能紊亂性疾病，男女的發(fā)病性別比為1∶7～1∶9[7]。目前，雖然對(duì)系統(tǒng)性紅斑狼瘡的研究相對(duì)深入，但其發(fā)病機(jī)制及病因均未完全肯定，免疫異常、內(nèi)分泌失調(diào)、感染、遺傳和環(huán)境等多因素相互作用而引起患者機(jī)體免疫體系的功能失調(diào)是其發(fā)病的根本原因[8-12]。研究表明，在系統(tǒng)性紅斑狼瘡活動(dòng)期，存在T細(xì)胞功能失調(diào)和B細(xì)胞多克隆活化現(xiàn)象，二者相互作用產(chǎn)生大量自身抗體，在與抗原結(jié)合后，形成免疫復(fù)合物沉積于組織器官，造成不同程度的免疫性損傷[13-14]。且系統(tǒng)性紅斑狼瘡在不同時(shí)期，患者外周血Tc與Th細(xì)胞比例失衡，特別在活動(dòng)期多出現(xiàn)Th、Tc細(xì)胞漂移現(xiàn)象[15-16]。T淋巴細(xì)胞平衡是保證二者間相互協(xié)同作用、發(fā)揮正常的免疫功能、維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)所必需的。T淋巴細(xì)胞由CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞兩個(gè)亞群組成，在骨髓的淋巴干細(xì)胞和胸腺中分化、發(fā)育成熟后，通過血液及淋巴循環(huán)遷往全身的免疫器官和組織中，二者釋放大量細(xì)胞因子和淋巴因子，發(fā)揮直接殺傷靶細(xì)胞和免疫功能。根據(jù)分泌的細(xì)胞因子和介導(dǎo)的免疫功能不同，CD4+細(xì)胞分為Th1、Th2兩個(gè)細(xì)胞亞群[17]。CD8+T細(xì)胞即Tc細(xì)胞，分為Tc1和Tc2兩個(gè)細(xì)胞亞群，為細(xì)胞毒性T細(xì)胞，Tc細(xì)胞能直接參與攻擊帶異抗原的腫瘤細(xì)胞、病毒感染細(xì)胞和異體細(xì)胞[18]。Th1細(xì)胞主要合成IFN-γ、IL-2，Th2細(xì)胞主要合成IL-4和IL-10，前者參與遲發(fā)型超敏反應(yīng)，后者參與速發(fā)型超敏反應(yīng)[19]。由此可見，CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞與自身免疫反應(yīng)和感染性疾病密切相關(guān)，CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞處于相對(duì)平衡狀態(tài)，一旦平衡關(guān)系被打破，出現(xiàn)Tc、Th失衡(即Tc1/Tc2及Th1/Th2發(fā)生漂移)，CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生的淋巴因子或細(xì)胞因子即會(huì)產(chǎn)生特異性自身抗體，與自身抗原結(jié)合形成免疫復(fù)合物，從而發(fā)生自身免疫性疾病[20]。因此，阻止或抑制這種細(xì)胞漂移現(xiàn)象可能防止免疫功能紊亂，治療這種自身免疫性疾病。自皮質(zhì)類固醇沖擊治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡至今，業(yè)已證實(shí)皮質(zhì)類固醇雖然治療作用顯著，但其不良反應(yīng)也日漸凸顯，且新的藥物及方法又沒有突破性進(jìn)展，為降低皮質(zhì)類固醇沖擊依賴，減少用量及停藥后反復(fù)或復(fù)發(fā)，優(yōu)化當(dāng)前治療方案、研究新藥或發(fā)掘老藥藥效以減少皮質(zhì)類固醇治療引起的免疫功能下降具有重要的現(xiàn)實(shí)意義[21]。

表2 治療不同階段IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10含量變化比較(n=6，pg/ml)

注：與模型組比較，*P<0.05；與治療前比較，#P<0.05；與0.25 mg/(kg·d)組比較，△P<0.05；與0.5 mg/(kg·d)組比較，▽P<0.05

表3 治療前和治療1個(gè)月、3個(gè)月時(shí)Th淋巴細(xì)胞亞群分類及比值比較(n=6，%)

注：與模型組比較，*P<0.05；與治療前比較，#P<0.05；與0.25 mg/(kg·d)組比較，△P<0.05；與0.5 mg/(kg·d)組比較，▽P<0.05

雷公藤多苷片是從中藥雷公藤中提取的生物堿，具有祛風(fēng)解毒、除濕消腫、舒筋活絡(luò)、抗炎及抑制細(xì)胞免疫和體液免疫等作用，臨床已用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腎病綜合征、麻風(fēng)病和系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病[22-23]。目前雷公藤多苷片治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡的機(jī)制分析，多借鑒于風(fēng)濕、類風(fēng)濕、腎炎等的機(jī)制，而對(duì)系統(tǒng)性紅斑狼瘡的外周血Tc、Th細(xì)胞漂移現(xiàn)象的影響機(jī)制缺乏系統(tǒng)研究。Pristane為一類可引起各類細(xì)胞因子異常分泌并導(dǎo)致細(xì)胞膜非特異性炎癥反應(yīng)的異抗原，肌肉或腹腔注射吸收后，可誘導(dǎo)多種細(xì)胞質(zhì)抗原和自身核抗原形成，是目前公認(rèn)的誘導(dǎo)系統(tǒng)性紅斑狼瘡的異抗原[24]。本實(shí)驗(yàn)采用雷公藤多苷灌服的方法，觀察其對(duì)由Pristane誘導(dǎo)的BALB/c裸鼠系統(tǒng)性紅斑狼瘡模型外周血Tc與Th細(xì)胞漂移的影響，分析雷公藤多苷調(diào)控與系統(tǒng)性紅斑狼瘡發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)的Tc與Th細(xì)胞漂移過程，為臨床治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

有研究表明，IFN-γ、IL-2可能促進(jìn)系統(tǒng)性紅斑狼瘡疾病的發(fā)展及組織器官損傷，而Th2細(xì)胞會(huì)減弱這一作用[25]。雷公藤多苷可能通過抑制Tc1細(xì)胞活化并促進(jìn)Th2細(xì)胞活化，而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。一般在系統(tǒng)性紅斑狼瘡活動(dòng)期，Tc1細(xì)胞百分比升高、Tc2細(xì)胞百分比降低，且在系統(tǒng)性紅斑狼瘡發(fā)病時(shí)，出現(xiàn)CD4+下降、CD8+升高的現(xiàn)象，這在模型組中得以證實(shí)，提示Tc1/Tc2、Th1/Th2比例失衡是系統(tǒng)性紅斑狼瘡自身免疫損傷惡性循環(huán)及加重的重要機(jī)制。而改變或抑制T細(xì)胞漂移可能阻斷免疫應(yīng)答并降低免疫損傷。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，0.25 mg/(kg·d)組Tc2和Th2細(xì)胞百分比、IL-4和IL-10含量較治療前、模型組同期和治療1個(gè)月時(shí)明顯升高，而Tc1和Th1百分比、Th1/Th2及Tc1/Tc2比值、IFN-γ和IL-2含量降低(P<0.05)。0.5 mg/(kg·d)組和1 mg/(kg·d)組Tc2和Th2細(xì)胞百分比、IL-4和IL-10含量在治療1個(gè)月和3個(gè)月時(shí)較治療前和模型組同期明顯升高，而Tc1和Th1百分比、Th1/Th2及Tc1/Tc2比值、IFN-γ和IL-2含量明顯降低，且0.5 mg/(kg·d)組與0.25 mg/(kg·d)組同期比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，1 mg/(kg·d)組與0.25 mg/(kg·d)組和0.5 mg/(kg·d)組同期比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

綜上所述，T細(xì)胞漂移影響Pristane誘發(fā)性紅斑狼瘡病理進(jìn)程，雷公藤多苷通過糾正Tc1/Tc2、Th1/Th2失衡，調(diào)節(jié)Th1和Th2分泌的細(xì)胞因子水平而影響免疫應(yīng)答來(lái)治療紅斑狼瘡，且這種作用具有劑量依賴性。