馮星月，余 輝，蔣志濤，張?jiān)伱?

0 引言

胃炎靈顆粒是張家港市中醫(yī)醫(yī)院的院內(nèi)制劑，由白芍、枳實(shí)、梔子、香附、郁金等組成。具有疏肝理氣、清肝瀉熱、解痙止痛之功效，主治膽汁反流性胃炎。CYP450酶是藥物體內(nèi)代謝的重要酶系[1]，其中6種重要的CYPs亞型-CYP2D6、CYP3A4、CYP2C19、CYP1A2、CYP2E1、CYP2C9參與了約90%的臨床使用藥物的代謝，CYP450酶被誘導(dǎo)或抑制是產(chǎn)生藥物相互作用的重要原因之一[2]。因此，推斷胃炎靈顆粒與其他藥物聯(lián)用時(shí)，可能會(huì)出現(xiàn)此現(xiàn)象?！癈ocktail”探針?biāo)幬锓ㄊ悄壳把芯緾YP450亞型酶活性的常用方法，能快速有效地評(píng)價(jià)藥物之間是否產(chǎn)生相互作用[3]。胃炎靈顆粒由中醫(yī)經(jīng)驗(yàn)方制成，且成分較為復(fù)雜，未見(jiàn)其對(duì)P450酶活性影響的報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)采用混合探針?lè)ǎ瑓⒖枷嚓P(guān)文獻(xiàn)[4-11]，分別選用右美沙芬(CYP2D6)、咪達(dá)唑侖(CYP3A4)、奧美拉唑(CYP2C19)、茶堿(CYP1A2)、氯唑沙宗(CYP2E1)、甲苯磺丁脲(CYP2C9)6種探針?biāo)幬?，考察胃炎靈顆粒在大鼠體內(nèi)對(duì)6種CYP450亞型酶活性的影響，預(yù)測(cè)其存在藥物相互作用的可能性，以提高臨床合并用藥的安全性，為胃炎靈顆粒的合理利用提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 藥品與試劑 胃炎靈顆粒(張家港市中醫(yī)醫(yī)院制劑室，規(guī)格：10 g/袋，批號(hào)：20170206)；咪達(dá)唑侖注射液(江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：20140602，規(guī)格：2 ml/10 mg)；注射用奧美拉唑鈉(江蘇奧賽康藥業(yè)有限公司，批號(hào)：15051811，規(guī)格：40 mg/支)；右美沙芬對(duì)照品(批號(hào)：097K11348)、咪達(dá)唑侖對(duì)照品(批號(hào)：171270-201402)、奧美拉唑?qū)φ掌?批號(hào)：BCBF-2161V)、替硝唑?qū)φ掌?批號(hào)：10036-200703)、茶堿批號(hào)對(duì)照品(T1633)、氯唑沙宗對(duì)照品(批號(hào)：017K1385)、甲苯磺丁脲對(duì)照品(批號(hào)：017K1025)、吡羅昔康對(duì)照品(批號(hào)：100177-200603)，其中咪達(dá)唑侖、替硝唑、吡羅昔康對(duì)照品為中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，奧美拉唑、右美沙芬、茶堿、氯唑沙宗、甲苯磺丁脲購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；甲醇、乙腈為色譜純，其余均為分析純。

1.2 儀器 Waters Quattro Micro液質(zhì)聯(lián)用儀(美國(guó)Waters公司)，Masslynx 4.1色譜工作站；MS105電子天平(上海梅特勒-托利多有限公司)；TGL-16G離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；IKA Vortex Genius渦旋混合儀(德國(guó)IKA公司)；Labconco離心濃縮儀(美國(guó)Labconco公司)；SCQ-250超聲波清洗器(上海盛普機(jī)械制造有限公司)；Drict-Q5超純水機(jī)(美國(guó)Millipore公司)。

1.3 動(dòng)物 健康雄性SPF級(jí)SD大鼠6只，由南京市江寧區(qū)青龍山動(dòng)物繁殖場(chǎng)提供，體重(240±20) g，合格證編號(hào)：SCXK(蘇)2017-0001。動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境溫度20～25 ℃，相對(duì)濕度50%～60%，自然光照。

2 方法

2.1 色譜條件 色譜柱：ACQUITYTM UPLC BEH C8色譜柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；流動(dòng)相：4 mmol/L甲酸銨+0.1%甲酸水溶液-乙腈(25/75，V/V)；流速：200 μl/min；進(jìn)樣量：5 μl；柱溫：30 ℃。

2.2 質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子化方式(ESI)，毛細(xì)管電壓為3 500 V，離子源溫度120 ℃，干燥氣溫度350 ℃，干燥氣體流速500 L/h。多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)模式(MRM)。正離子模式監(jiān)測(cè)：替硝唑(內(nèi)標(biāo))、右美沙芬、咪達(dá)唑侖、奧美拉唑；負(fù)離子模式監(jiān)測(cè)：吡洛昔康(內(nèi)標(biāo))、茶堿、氯唑沙宗、甲苯磺丁脲。①替硝唑：m/z 248.1/121.1，錐孔電壓30 V，碰撞能力15 eV；②右美沙芬：m/z 272.1/171.1，錐孔電壓45 V，碰撞能力35 eV；③咪達(dá)唑侖：m/z 326.0/291.0，錐孔電壓35 V，碰撞能力28 eV；④奧美拉唑：m/z 346.0/198.0，錐孔電壓40 V，碰撞能力15 eV；⑤吡羅昔康：m/z 330.2/146.2，錐孔電壓25 V，碰撞能力為20 eV；⑥茶堿：m/z 179.0/164.1，錐孔電壓30 V，碰撞能力20 eV；⑦甲苯磺丁脲：m/z 168.0/132，錐孔電壓35 V，碰撞能力20 eV；⑧氯唑沙宗：m/z 168.0/132.0，錐孔電壓30 V，碰撞能力18 eV。

2.4 溶液的配制

2.4.1 Cocktail探針?biāo)幬锶芤号渲?分別稱取6種探針?biāo)幬镞m量，加入適量0.5%羧甲基纖維素鈉研磨混勻，用生理鹽水定容至50 ml棕色量瓶中，得含茶堿、苯磺丁脲、右美沙芬、氯唑沙宗、咪達(dá)唑侖、奧美拉唑鈉濃度分別為0.5、0.4、0.6、1.2、0.4、0.8 mg/ml的混合探針?biāo)幬锶芤?。此步驟所得溶液臨用前配制。

2.4.2 混合對(duì)照品、內(nèi)標(biāo)及質(zhì)控溶液配制 精密稱取各探針?biāo)幬飳?duì)照品適量，于同一10 ml量瓶中，加甲醇定容，配制成含茶堿、氯唑沙宗、甲苯磺丁脲、右美沙芬、奧美拉唑、咪達(dá)唑侖分別為564、720、408、10.24、10、10.76 μg/ml的混合儲(chǔ)備液。臨用時(shí)按倍比稀釋法配制成一系列濃度的甲醇混合對(duì)照品工作液。精密移取上述儲(chǔ)備液，臨用時(shí)依次配制成高、中、低3種不同質(zhì)量濃度的甲醇質(zhì)控溶液供分析用。

精密稱取內(nèi)標(biāo)替硝唑和吡羅昔康對(duì)照品適量，于同一10 ml量瓶中，加甲醇溶解，搖勻定容，得混合內(nèi)標(biāo)溶液。精密吸取上述溶液，加甲醇稀釋，得到替硝唑終濃度為1.6 μg/ml、吡羅昔康終濃度為24.2 μg/ml的混合內(nèi)標(biāo)工作液，于4 ℃冷藏備用。

2.4.3 大鼠灌胃藥物的制備 精密稱取胃炎靈顆粒12.5 g于50 ml量瓶，加入0.5%羧甲基纖維素鈉溶液適量，攪拌使其溶解，再定容至刻度，超聲處理10 min，即得。

2.5 動(dòng)物給藥方法 6只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，為了避免個(gè)體差異的干擾，采用自身對(duì)照法，進(jìn)行前后兩輪對(duì)比實(shí)驗(yàn)。第1輪，每天上午灌胃混合探針?biāo)幬?0 ml/kg，給藥前12 h禁食不禁水，分別于給藥前和給藥后0.083、0.167、0.333、0.667、1、1.5、2、2.5、3、5、8、12、24 h從眼底靜脈叢采血，4 000 r/min離心10 min后，吸取上清液于-20 ℃保存待用。第1輪結(jié)束后，進(jìn)行第2輪實(shí)驗(yàn)，每天上午灌胃胃炎靈顆粒(4 g/kg)，連續(xù)灌胃10 d，于第11天上午再次灌胃探針?biāo)幬铮笫蠼o藥劑量、取血時(shí)間點(diǎn)及全血處理方法均與第1輪相同。

2.6 血漿樣品處理方法 參考文獻(xiàn)[4]處理血漿樣品，取100 μl大鼠血漿樣品，加入10 μl混合內(nèi)標(biāo)工作液(替硝唑終濃度為1.6 μg/ml、吡羅昔康終濃度為24.2 μg/ml)，渦旋混勻30 s，加入800 μl

的乙酸乙酯，渦旋混勻3 min，以12 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，吸取上清液于2 ml離心管中，40 ℃水浴條件下氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)?00 μl 50%的甲醇水復(fù)溶，渦旋混勻3 min，12 000 r/min離心10 min，取上清進(jìn)樣5 μl檢測(cè)。

3 結(jié)果

3.1 色譜行為 此色譜條件下，6種探針?biāo)幬锱c內(nèi)標(biāo)分離良好，且血漿測(cè)定中無(wú)雜峰干擾，基線平穩(wěn)(見(jiàn)圖1～圖3)。表明該測(cè)定方法特異性良好，能準(zhǔn)確測(cè)定血漿中右美沙芬、咪達(dá)唑侖、奧美拉唑、茶堿、氯唑沙宗、甲苯磺丁脲的濃度，且重現(xiàn)性好。

圖1 空白血漿色譜圖

3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 取空白血漿100 μl數(shù)份，加入“2.4.2”項(xiàng)下方法配制的一系列工作液10 μl，再加入混合內(nèi)標(biāo)10 μl，按“2.6”項(xiàng)下方法加入混合內(nèi)標(biāo)之后的方法處理。根據(jù)血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線所測(cè)結(jié)果，以各探針?biāo)幬锏馁|(zhì)量濃度為X、各成分的峰面積與相應(yīng)內(nèi)標(biāo)的峰面積比值為Y、1/x2為加權(quán)因子，進(jìn)行線性回歸分析，得回歸方程。見(jiàn)表1。

表1 6種探針?biāo)幬锏木€性關(guān)系及定量限LOQ考察(μg/ml，n=6)

圖2 空白血漿+混合探針+混合內(nèi)標(biāo)色譜圖

圖3 1 h后的血漿樣本各探針?biāo)幬锛皟?nèi)標(biāo)的代表性色譜圖

3.3 精密度 按“3.2”項(xiàng)下方法制備含6種探針?biāo)幬锏母?、中、低濃度的含藥血漿，每個(gè)濃度平行5份，按“2.6”項(xiàng)下方法處理樣品，測(cè)定對(duì)照品峰面積As，及內(nèi)標(biāo)峰面積Ai，與標(biāo)準(zhǔn)曲線同日測(cè)定，日內(nèi)重復(fù)測(cè)定5次，連續(xù)測(cè)定3 d，通過(guò)峰面積比值A(chǔ)s/Ai，計(jì)算日內(nèi)、日間精密度，結(jié)果見(jiàn)表2。

3.4 提取回收率與基質(zhì)效應(yīng) 按“3.3”項(xiàng)下方法制備高、中、低3個(gè)質(zhì)控濃度的含藥血漿，每個(gè)濃度平行3份，按“2.6”項(xiàng)下方法處理樣品，測(cè)得各對(duì)照品及內(nèi)標(biāo)的峰面積為A。另取空白大鼠血漿100 μl數(shù)份，按照“2.6”項(xiàng)下方法操作，在乙酸乙酯萃取后吸取的上清液中加入對(duì)應(yīng)濃度的混合對(duì)照品溶液和內(nèi)標(biāo)，同法操作，得峰面積B。另取上述與濃度相同的質(zhì)控混合溶液和混合內(nèi)標(biāo)，按“2.6”項(xiàng)下“氮?dú)獯蹈伞焙蠓椒ú僮鳎梅迕娣eC。A/B為提取回收率，B/C為基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果見(jiàn)表2，提取回收率及基質(zhì)效應(yīng)均符合要求。

表2 6種探針?biāo)幬镌谘獫{中的準(zhǔn)確度、日內(nèi)日間精密度、回收率和基質(zhì)效應(yīng)(n=5)

3.5 穩(wěn)定性 取“2.4.2”項(xiàng)下方法制備的中濃度質(zhì)控溶液，按“2.1”項(xiàng)下的分析條件，對(duì)在室溫下0、1、2、4、8、24 h及在4 ℃保存2個(gè)月的樣品進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算各個(gè)探針?biāo)幬餄舛鹊腞SD；另取“3.3”項(xiàng)下制備的含中濃度混合探針?biāo)幬锏难獫{，按“2.5”項(xiàng)下的血漿樣品處理方法及“ 2.1”項(xiàng)下的分析條件，對(duì)在室溫下 0、1、2、4、8、24 h及在-20 ℃內(nèi)冷凍保存7 d 內(nèi)的樣品進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算各個(gè)混合探針?biāo)幬餄舛鹊腞SD。結(jié)果表明，6種探針?biāo)幬锏姆€(wěn)定性良好。

3.6 藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

3.6.1 6種探針?biāo)幬锏乃?時(shí)曲線圖 大鼠連續(xù)灌胃胃炎靈顆粒10 d前后灌胃混合探針?biāo)幬?，按?.5”項(xiàng)下血漿樣品處理方法及“2.1”項(xiàng)下的分析條件，得6種探針?biāo)幬锏乃?時(shí)曲線圖，見(jiàn)圖4。

圖4 6種探針?biāo)幬锝o藥前后的藥-時(shí)曲線

3.6.2 6種探針?biāo)幬锏乃巹?dòng)學(xué)參數(shù) 6只大鼠前后兩輪藥代動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)經(jīng)DAS 1.0軟件處理，右美沙芬符合一室模型(W=1/C)，咪達(dá)唑侖符合二室模型(W=1)，奧美拉唑符合一室模型(W=1)，茶堿和甲苯磺丁脲符合一室模型(W=1/CC)，氯唑沙宗符合二室模型(W=1/CC)。6種探針?biāo)幬锏闹饕巹?dòng)學(xué)參數(shù)見(jiàn)表3。

4 討論

通過(guò)參考文獻(xiàn)中6種CYP450亞型探針底物右美沙芬、咪達(dá)唑侖、奧美拉唑、茶堿、氯唑沙宗和甲苯磺丁脲的檢測(cè)方法[4-11]，本實(shí)驗(yàn)建立了生物樣品中6種探針?biāo)幬锖康腖C-MS-MS檢測(cè)方法；采用“Cocktail”法評(píng)價(jià)胃炎靈顆粒對(duì)大鼠體內(nèi)CYP450酶6種亞型的影響。有報(bào)道，大鼠常被用來(lái)研究CYPs酶活性，預(yù)測(cè)有可能產(chǎn)生的抑制或誘導(dǎo)藥物相互作用[12]，這主要是因?yàn)榇笫篌w內(nèi)參與代謝的主要酶亞型與人類相似[13]。本實(shí)驗(yàn)采用整體動(dòng)物自身對(duì)照的方法，均選用雄性SD大鼠，由于雄性大鼠體內(nèi)CYP3A的活性與人體相似且較雌性大鼠高5～10倍[13]，此方法更有說(shuō)服力，并且將動(dòng)物個(gè)體間的遺傳代謝差異降低到最小[14]。筆者參考文獻(xiàn)[6]，確定6種探針?biāo)幬镌隗w內(nèi)不存在潛在代謝性相互作用，且實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)基本符合Cocktail法的條件。

由表4可知，甲苯磺丁脲CL/F降低31%，Cmax、AUC0-t、AUC0-∞依次升高約1.33、1.43、1.38倍(弱抑制劑的1.25～2倍[15])，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。氯唑沙宗Tmax、Cmax、AUC0-t、AUC0-∞依次降低約48%、23%、31%、31%(P<0.01)。奧美拉唑Cmax、AUC0-t、AUC0-∞依次升高約1.22、1.01、1.02倍(P<0.05)。右美沙芬CL/F、Cmax、AUC0-t、AUC0-∞依次升高約2.7、3.78、2.22、2.18倍(中強(qiáng)抑制劑的2～5倍[15])(P<0.01)。茶堿Tmax、Cmax、AUC0-t、AUC0-∞均略有降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。咪達(dá)唑侖Cmax、AUC0-t、AUC0-∞略有升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

綜上所述，胃炎靈顆粒連續(xù)給予10 d后，右美沙芬、甲苯磺丁脲在大鼠體內(nèi)的濃度升高，代謝減慢。結(jié)果表明，胃炎靈顆粒對(duì)CYP2D6有中強(qiáng)抑制作用，對(duì)CYP2C9有弱抑制作用。氯唑沙宗在大鼠體內(nèi)的濃度降低，代謝加快，表明胃炎靈顆粒對(duì)CYP2E1有弱誘導(dǎo)作用。咪達(dá)唑侖、奧美拉唑和茶堿的代謝變化不明顯，表明胃炎靈顆粒對(duì)CYP3A4、CYP2C19、CYP1A2基本沒(méi)有影響。由本試驗(yàn)結(jié)果推測(cè)，胃炎靈顆?？赡軐?duì)CYP2E1有誘導(dǎo)作用，對(duì)CYP2D6、CYP2C9有抑制作用，因此在臨床上胃炎靈顆粒與其他經(jīng)CYP2D6、CYP2C9、CYP2E1代謝的藥物合用時(shí)，應(yīng)考慮對(duì)其代謝的影響。為了避免由代謝性相互作用導(dǎo)致的藥物療效降低或毒副作用，提高臨床用藥的安全性和有效性，應(yīng)充分考慮兩者合用的劑量。

表3 6種探針?biāo)幬锏闹饕巹?dòng)學(xué)參數(shù)(n=6)

注：與給藥前比較，*P<0.05，**P<0.01