曲超，劉奎，王一休，劉鵬，李坤，胡維昱，王祖森，曹景玉

（青島大學(xué)附屬醫(yī)院 肝膽胰外科，山東 青島 266003）

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC，以下簡稱肝癌）的惡性程度很高，在惡性腫瘤導(dǎo)致的死亡原因中居于第三位[1]。肝癌不經(jīng)任何治療其中位生存時(shí)間＜1年，嚴(yán)重威脅人類的健康[2]。目前肝癌的治療方式包括：手術(shù)、肝移植、消融術(shù)、介入、化療、放療、分子靶向藥物、免疫治療等；其中手術(shù)和肝移植是目前最有效的治療方法[3]。但肝癌的高復(fù)發(fā)率使患者的預(yù)后變得很差。有國外學(xué)者[4]的臨床病例分析報(bào)道肝癌患者行腫瘤切除術(shù)后，腫瘤復(fù)發(fā)的患者高達(dá)70%以上。在影響肝癌預(yù)后的各種危險(xiǎn)因素中，肝癌的微血管侵犯（microvascular invasion，MVI）已被證明是預(yù)測(cè)術(shù)后高復(fù)發(fā)和低存活率的獨(dú)立因素[5-6]。在中國，慢性乙型肝炎病毒（HBV）相關(guān)的肝癌是最常見的肝癌類型[7]，HBV感染是肝硬化和肝癌發(fā)展的主要風(fēng)險(xiǎn)因素[8]，高乙肝表面抗原水平和高HBV DNA負(fù)荷，被發(fā)現(xiàn)能明顯增加HBV相關(guān)肝硬化和肝癌的風(fēng)險(xiǎn)[9-10]。基礎(chǔ)研究[11-12]發(fā)現(xiàn)，HBV啟動(dòng)的腫瘤發(fā)生過程可能在肝癌微血管侵襲的發(fā)展中起作用。最近，有學(xué)者[13]建立了一個(gè)用于術(shù)前預(yù)測(cè)HBV相關(guān)的肝癌中MVI存在的列線圖，其中表明高HBV DNA負(fù)荷與MVI的發(fā)展獨(dú)立相關(guān)。這些研究結(jié)果表明HBV感染及活動(dòng)性復(fù)制與肝癌中MVI發(fā)展之間存在潛在的相關(guān)性。本研究旨在進(jìn)一步探討HBV感染及抗HBV治療對(duì)肝癌MVI形成的影響。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

2015年1月—2017年12月，青島大學(xué)附屬醫(yī)院收治肝癌患者共924例。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)共納入660例患者。其中男534例，女126例，男性比例為80.9%；平均年齡為56歲（范圍：30～83歲）。入選標(biāo)準(zhǔn)：⑴ 術(shù)前診斷為肝細(xì)胞癌并行根治性切除手術(shù)；⑵ 術(shù)后經(jīng)病理學(xué)檢查確診為肝細(xì)胞肝癌。排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴ 丙型肝炎病毒（HCV）及有其他肝炎感染史相關(guān)的肝癌；⑵ 術(shù)前曾行肝動(dòng)脈化療栓塞術(shù)（TACE）或放療治療史；⑶ 非根治性切除或復(fù)發(fā)病變；⑷ 缺乏完整的臨床或病理信息。

本研究經(jīng)青島大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。所有研究參與者或其法定監(jiān)護(hù)人在研究登記前提供了書面知情同意書。

1.2 研究方法

收集患者一般臨床資料（性別、年齡、既往史、個(gè)人史、HBV感染相關(guān)指標(biāo)，肝功能相關(guān)指標(biāo)、相關(guān)腫瘤標(biāo)志物）及病理資料（腫瘤最大直徑、腫瘤數(shù)目、腫瘤分化程度、腫瘤包膜是否完整、肝硬化及衛(wèi)星結(jié)節(jié)）。以上數(shù)據(jù)資料陽性值的確定是根據(jù)青島大學(xué)附屬醫(yī)院臨床數(shù)據(jù)的正常值參考范圍或是根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的陽性值確立的。通過實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)法（real-time quantitative PCR）定量血清HBV-DNA水平，檢測(cè)下限為100 IU/mL。肝癌根治性切除術(shù)定義為：⑴ 肝靜脈、門靜脈、膽管以及下腔靜脈未見肉眼癌栓；⑵ 無鄰近臟器侵犯，無肝門淋巴結(jié)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；⑶ 肝臟切緣距腫瘤邊界＞1 cm；如切緣＜1 cm，但切除肝斷面組織學(xué)檢查無腫瘤細(xì)胞殘留，即切緣陰性[14]。接受標(biāo)準(zhǔn)干擾素治療或在手術(shù)前持續(xù)使用口服抗病毒藥物超過6個(gè)月的患者被歸類為抗病毒治療組，總共有172例患者（26.1%）。入組患者持續(xù)服用抗病毒藥物半年以上，分別有干擾素5例，拉米夫定7例，阿德福韋酯30例，恩替卡韋95例患者；恩替卡韋+阿德福韋酯27例，其他8例。

1.3 MVI的定義

MVI的定義主要是根據(jù)2015年發(fā)布的關(guān)于肝癌規(guī)范化病理診斷指南[15]：影像學(xué)檢查和肉眼觀察未見明顯的血管內(nèi)癌栓，顯微鏡下微血管中可見癌栓或癌細(xì)胞巢。測(cè)量入侵血管的數(shù)量和分布，將MVI患者分為兩組：輕度MVI組（M1）患者在距腫瘤邊緣1 cm區(qū)域內(nèi)有1～5個(gè)受累血管，而嚴(yán)重的MVI組（M2）中有超過5個(gè)MVI或受累血管距離腫瘤邊緣＜1 cm。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有計(jì)算均使用Stata 19.0軟件進(jìn)行。首先采用Pearson χ2檢驗(yàn)，F(xiàn)isher精確檢驗(yàn)進(jìn)行分類資料的比較。對(duì)單因素方差分析結(jié)果中有意義的變量進(jìn)行多因素二元Logistic回歸分析用于評(píng)估MVI的存在與變量之間的關(guān)系，使用逐步回歸的方法，選入變量和剔除變量的水準(zhǔn)分別為P=0.05和P=0.10，來確定影響MVI形成的獨(dú)立危險(xiǎn)因素及保護(hù)因素。由于病毒因素（包括HBV DNA載量，肝硬化的存在和抗病毒治療的使用）僅在HBV感染患者中有意義，因此只有HbsAg陽性的患者被納入多因素分析。采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)分析MVI嚴(yán)重程度與乙肝相關(guān)因素的關(guān)系，其中HBsAg因素的分析對(duì)象包括所有患者，其他因素僅包含HBsAg陽性患者。檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05

2 結(jié) 果

2.1 一般資料

660例患者中，MVI的發(fā)生率為46.8%（309/660）。MVI陰性組男272例，女79例，男性占比為77.5%；年齡31～83歲，平均57歲。MVI陽性組男262例，女47例，男性占比為84.8%；年齡30～82歲，平均55歲。87.1%（575/660）的患者有HBV相關(guān)肝癌，其余85例（12.9%）HBsAg陰性。共有311例患者（47.1%）有可檢測(cè)的HBV DNA載量（＞100 IU/mL），其中253例（38.3%）HBV DNA載量＞1000 IU/mL。

2.2 單因素方差分析HBV及腫瘤相關(guān)因素對(duì)MVI形成的影響

單因素方差分析結(jié)果顯示：病毒相關(guān)血清標(biāo)志物，包括H B s A g陽性（P=0.04）和可檢測(cè)到的H B V D N A載量（P＜0.001）以及肝硬化（P=0.006）的存在與MVI的形成有關(guān)，而接受抗病毒治療（P=0.016）的患者發(fā)生M V I的風(fēng)險(xiǎn)明顯降低。其他的腫瘤相關(guān)因素還表現(xiàn)出兩組間有明顯差異的有：基本資料中的性別（P=0.008）、年齡（P=0.017）等因素；術(shù)前血清學(xué)檢查結(jié)果中的甲胎蛋白（AFP）（P＜0.001）、癌抗原125（CA125）（P=0.010）、總膽紅素（P=0.032）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（P＜0.001）、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（P＜0.001）等因素；病理學(xué)檢查結(jié)果中的，Edmondson-Steiner組織學(xué)分級(jí)（P＜0.001）、腫瘤最大直徑（P＜0.001）、腫瘤數(shù)目（P=0.002）、包膜是否完整（P＜0.001）、是否存在衛(wèi)星結(jié)節(jié)（P＜0.001）等因素（表1）。

2.3 多因素二元Logistic回歸分析MVI的獨(dú)立影響因素

采用多因素Logistic回歸對(duì)HBsAg陽性患者分析MVI的獨(dú)立影響因素，結(jié)果顯示，可檢測(cè)的血清HBVDNA載量是肝癌MVI的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（OR=5.33，P＜0.001）?？笻BV治療半年以上是肝癌MVI的獨(dú)立保護(hù)因素（OR=0.37，P=0.002）。此外，腫瘤相關(guān)因素，包括男性患者（OR=2.16，P=0.004），AFP水平＞7.02 ng/mL（OR=2.86，P＜0.001)，腫瘤直徑＞3 cm（OR=2.20，P＜0.001），Edmondson-Steiner組織學(xué)分級(jí)III/IV（OR=2.97，P＜0.001），腫瘤包膜不完整（OR=1.96，P=0.001），存在衛(wèi)星結(jié)節(jié)（OR=3.60，P＜0.001）與肝癌MVI的形成有明顯獨(dú)立相關(guān)（表2）。

表1 HBV及腫瘤相關(guān)因素與MVI形成關(guān)系的單因素分析[n（%）]Table1 Univariate analysis of relations of MVI formation with the HBV- and tumor-related factors [n (%)]

表2 HBsAg陽性患者M(jìn)VI獨(dú)立影響因素的Logistic回歸分析Table2 Multivariate logistic regression analysis of independent factors for MVI in HbsAg positive patients

2.4 Kruskal-Wallis檢驗(yàn)分析MVI嚴(yán)重程度與HBV相關(guān)因素的關(guān)系

MVI陰性組、M1組、M2組之間HBsAg陽性率、可檢測(cè)到的HBV DNA載量（＞100 IU/mL）、抗病毒治療率和有無肝硬化的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中嚴(yán)重MVI組與輕度MVI組和MVI陰性組相比有更高的HBsAg陽性率（94.0%，P=0.017），更高的可檢測(cè)到的H B V D N A載量（68.3%，P=0.001）及更低的抗病毒治療率（22.8%，P=0.012）。輕度MVI組的肝硬化患者比例是最高（80.0%）（表3）。

表3 MVI嚴(yán)重程度與HBV相關(guān)因素的關(guān)系[n（%）]Table3 Relationship between MVI severity and HBV related factors [n (%)]

3 討 論

肝癌的惡性程度之高不僅表現(xiàn)在腫瘤本身，還表現(xiàn)在術(shù)后的高復(fù)發(fā)率。肝癌的高復(fù)發(fā)率是多種因素共同作用的結(jié)果，許多學(xué)者對(duì)此都進(jìn)行了深入的研究。有學(xué)者[16]對(duì)249例肝臟腫瘤切除術(shù)后的患者研究分析其預(yù)后情況，在對(duì)于術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)方面，MVI是重要的指標(biāo)之一。肝癌MVI發(fā)生的一個(gè)重要途徑就是肝癌細(xì)胞經(jīng)過肝臟的微血管傳播，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞形成肝內(nèi)的轉(zhuǎn)移[16]。另外，有學(xué)者[17]對(duì)施行手術(shù)的肝癌患者研究發(fā)現(xiàn)MVI的患者出現(xiàn)肝內(nèi)微轉(zhuǎn)移灶高達(dá)30%以上，更進(jìn)一步論證了肝癌MVI與肝癌術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)關(guān)系密切。國外有學(xué)者[18]進(jìn)一步研究了腫瘤的中位復(fù)發(fā)率，發(fā)現(xiàn)MVI陽性組和MVI陰性組腫瘤中位復(fù)發(fā)的時(shí)間分別為12、42.2個(gè)月，MVI組中位復(fù)發(fā)時(shí)間明顯早于無MVI組。以上研究均表明MVI與肝癌的術(shù)后復(fù)發(fā)關(guān)系密切。

同時(shí)在肝癌患者最多的亞太地區(qū)，肝癌患者的HBV感染率在70%到90%之間，在中國地區(qū)尤為嚴(yán)重[19]。已有研究[8]證明，慢性HBV感染是肝硬化和肝癌發(fā)展的主要風(fēng)險(xiǎn)因素，同時(shí)國內(nèi)學(xué)者[20-21]的研究表明術(shù)前肝癌患者血清HBV DNA載量越高，手術(shù)相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)大，引起手術(shù)并發(fā)癥的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，與術(shù)后預(yù)后不良相關(guān)。更有研究[11-12]表明，HBV啟動(dòng)的腫瘤發(fā)生過程可能在肝癌MVI的發(fā)展中起作用。從而把HBV感染和MVI的形成聯(lián)系在了一起。為了建立MVI的術(shù)前預(yù)測(cè)模型，有研究分析了大量HBV感染相關(guān)肝癌患者（n=1004），發(fā)現(xiàn)高水平的HBV DNA載量（＞104IU/mL）是一個(gè)MVI的存在的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。根據(jù)這些學(xué)者先前的研究結(jié)果，本研究收集了盡可能多的完整臨床數(shù)據(jù)，以通過科學(xué)研究方法進(jìn)一步揭示HBV感染與肝癌MVI之間的關(guān)系。本研究結(jié)果明確提示，除了腫瘤相關(guān)因素外，HBV感染和活躍復(fù)制在肝癌患者M(jìn)VI的發(fā)展中起關(guān)鍵作用。

抗病毒治療是MVI形成的保護(hù)性因素。研究發(fā)現(xiàn)，HBV感染相關(guān)因素（包括高肝炎活動(dòng)評(píng)分和高HBV DNA負(fù)荷）與晚期復(fù)發(fā)顯著相關(guān)，而抗病毒藥物持續(xù)抑制HBV復(fù)制的晚期復(fù)發(fā)率較低[22-24]。另外我國學(xué)者[25]研究發(fā)現(xiàn)抗病毒治療能明顯改善肝癌合并HBV感染患者術(shù)后的肝功能和病毒學(xué)指標(biāo)。手術(shù)后2年內(nèi)復(fù)發(fā)的肝癌被認(rèn)為是早期復(fù)發(fā)，這與腫瘤相關(guān)因素密切相關(guān)，包括腫瘤大小，結(jié)節(jié)的存在，血管侵犯和切除邊緣[26-27]。一項(xiàng)隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)[28]發(fā)現(xiàn)接受抗病毒治療的患者的總生存期顯著更長（93.8%vs.62.2%）和無復(fù)發(fā)生存期（55.6%vs.19.5%），這一研究表明抗病毒治療對(duì)肝癌的晚期復(fù)發(fā)具有抑制作用。本研究結(jié)果表明，活躍的HBV復(fù)制與肝癌患者微血管侵襲率高有關(guān)，同時(shí)性抗病毒治療半年以上的患者發(fā)生MVI的可能性較低，從而可以降低肝癌的遠(yuǎn)期復(fù)發(fā)可能。這很好的解釋了抗病毒治療的抗腫瘤作用?？梢缘贸鲞@樣的結(jié)論，通過抗病毒治療抑制HBV復(fù)制可能降低肝癌的侵襲性和轉(zhuǎn)移潛能以降低術(shù)后復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。

根據(jù)目前最新的抗HBV指南推薦根據(jù)HBV DNA水平：HBeAg陽性患者，HBV DNA ≥20000 IU/mL；HBeAg陰性患者，HBV DNA ≥2000 IU/mL建議接受抗病毒治療[29]。但根據(jù)本研究中的發(fā)現(xiàn)，檢測(cè)不到HBV DNA載量（≤100 IUmL）的肝癌患者M(jìn)VI發(fā)生率明顯低于可檢測(cè)到HBV DNA載量（＞ 100 IUmL）的患者。這些結(jié)果表明，對(duì)于不滿足當(dāng)前治療適應(yīng)證的患者接受抗病毒藥物也是有益的。同時(shí)指南推薦存在明確肝硬化客觀依據(jù)的患者，無論丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和HBeAg情況，均建議積極抗病毒治療。本研究中，M1組肝硬化率是最高的，但抗病毒治療率較M2組是高的，或許正是由于肝硬化的存在，使得更多地患者能及時(shí)的抗病毒治療，從而降低了MVI形成的嚴(yán)重程度。這也從另一個(gè)角度說明抗病毒治療對(duì)MVI的嚴(yán)重程度的影響。同時(shí)在最新的中國肝癌一級(jí)預(yù)防專家共識(shí)[30]中，著重的強(qiáng)調(diào)了抗HBV治療對(duì)肝癌的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后的重要性，這也為本研究結(jié)果提供了有效的支持。

本研究可能無法詳細(xì)的揭示HBV的感染與活動(dòng)性復(fù)制是如何促進(jìn)肝癌MVI發(fā)生的。特別是由于隨訪時(shí)間有限，未能進(jìn)行生存分析來確定導(dǎo)致復(fù)發(fā)或生存的重要因素。然而，本研究主要是為了探索HBV感染及活動(dòng)性復(fù)制與肝癌MVI的關(guān)系，缺乏生存信息可能對(duì)本研究的結(jié)論影響較小。此外，抗病毒治療方案的不同以及對(duì)不同患者采取的手術(shù)方式的不同，可能對(duì)本研究結(jié)果產(chǎn)生些許影響。但盡管有這些不足的存在，HBV感染對(duì)MVI形成的促進(jìn)作用以及抗病毒治療對(duì)MVI形成的保護(hù)作用是顯著的。最后，本研究僅針對(duì)HBV相關(guān)肝癌進(jìn)行了研究，結(jié)論不適用于其他肝病毒引起的肝癌。

總之，除了腫瘤本身的因素之外，HBV DNA水平是肝癌MVI的形成的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，抗病毒治療可能預(yù)防肝癌中MVI的形成。對(duì)于HBV DNA檢測(cè)陽性的慢性HBV感染相關(guān)的肝癌患者，應(yīng)該認(rèn)識(shí)到MVI增加的風(fēng)險(xiǎn)并及時(shí)干預(yù)。