杜夢(mèng)夢(mèng) ，鄢澤然 ，陳穎穎 ，周 麗 ，陶慶文 ★

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；2.中日友好醫(yī)院 中醫(yī)風(fēng)濕病科，中日友好醫(yī)院 免疫炎性疾病北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100029）

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是由多種因素導(dǎo)致的以軟骨下骨破壞、關(guān)節(jié)軟骨變性、滑膜炎和關(guān)節(jié)邊緣骨贅形成為特征的慢性關(guān)節(jié)病變。據(jù)統(tǒng)計(jì)我國每年骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病率約8.1%，隨著年齡增長，發(fā)病率也逐年上升[1]。骨關(guān)節(jié)炎常伴有關(guān)節(jié)腫脹、疼痛、僵硬、活動(dòng)受限等癥狀。中藥在治療骨關(guān)節(jié)炎上有著很大的優(yōu)勢(shì)，前期研究[2]發(fā)現(xiàn)骨痹通方改善膝骨關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)疼痛、僵硬及活動(dòng)困難程度等方面療效顯著。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)也證實(shí)骨痹通方可以抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路中Wnt5a、β-catenin的表達(dá)從而達(dá)到保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨，抑制軟骨細(xì)胞凋亡的作用[3]。本實(shí)驗(yàn)通過觀察骨痹通方調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路影響大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎基質(zhì)金屬蛋白酶-3（matrix met alloproteinase-3，MMP-3）、Ⅱ型膠原酶（type Ⅱ collagenase，COL-Ⅱ）的表達(dá)，進(jìn)一步探索骨痹通方保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨的機(jī)制及具體作用靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

選用6周齡無特殊病原體級(jí) （SPF級(jí)）雄性Sprague-Dawley （SD）大鼠 35 只，體重 220～250g，中國藥品生物制品檢定所提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（京）2014-001，在中日友好臨床研究所清潔級(jí)動(dòng)物室喂養(yǎng)。

主要試劑有逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號(hào)：A3500），美國 Promega公司生產(chǎn)；Power SYBR Green PCR Master Mix 試劑盒（批號(hào)：QPK-201），日本 TOYOBO公司生產(chǎn)；引物合成由廣州復(fù)能Genecopoeia合成；Wnt5a（批號(hào)：ab174963）、β-catenin（批號(hào)：ab32572）、COL-Ⅱ （批號(hào)：ab34712）、MMP-3 （批號(hào)：ab53015）、β-actin （批號(hào)：ab8227）， 均由英國abcam公司生產(chǎn)；二抗（批號(hào)：ab6721），英國abcam公司生產(chǎn)。

鹽酸氨基葡萄糖膠囊，北京康必得藥業(yè)有限公司生產(chǎn)（批號(hào)：05170513）。

儀器有美國MJResearch基因擴(kuò)增儀 （TTC-220）；Applied Biosystems PCR 儀（ABI7500）；BIORAD 電泳儀 （042BR03674）；BIO-RAD 酶標(biāo)儀（721BR16681）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組與造模

雄性SD大鼠35只隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組、模型組、鹽酸氨基葡萄糖組和骨痹通組，每組7只?？瞻捉M不干預(yù)，假手術(shù)組僅暴露膝關(guān)節(jié)不切斷韌帶，其余組均Hulth法造模。造模方法如下：將大鼠用10%水合氯醛麻醉后仰臥于手術(shù)臺(tái)上，無菌條件下取膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)縱切口長約2cm，顯露膝關(guān)節(jié)，切斷前后交叉韌帶，取出內(nèi)側(cè)半月板，然后雙層縫合傷口。術(shù)后予青霉素10萬IU/只腹腔注射1周，預(yù)防感染。

1.2.2 藥物制備

骨痹通方藥物組成：骨碎補(bǔ)20g、補(bǔ)骨脂15g、淫羊藿 15g、杜仲 30g、燙狗脊 30g、青風(fēng)藤 30g、雞血藤30g、土貝母20g。均由中日友好醫(yī)院中藥房提供，由中日友好醫(yī)院制劑室進(jìn)行藥物濃縮制備，使終濃度達(dá)到含生藥4g/ml。

1.2.3 藥物干預(yù)方法

正常組、假手術(shù)組和模型組給予3ml/只/d生理鹽水灌胃，鹽酸氨基葡萄糖組予0.065g/kg/d灌胃，骨痹通組用藥量按照人與大鼠體表面積等效劑量比值計(jì)算，予17g/kg/d灌胃。共灌胃6周。

1.2.4 取材

灌胃治療完成后，大鼠10%水合氯醛4ml/kg麻醉下，取手術(shù)側(cè)膝關(guān)節(jié)，低溫環(huán)境下提取膝關(guān)節(jié)軟骨，放置-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 檢測(cè)方法與指標(biāo)

表1 相關(guān)引物序列

表2 Wnt5a、β-catenin、MMP-3、COL-Ⅱ的基因相對(duì)表達(dá)量

以每組5只樣本進(jìn)行檢測(cè)。用軟骨RNA提取試劑盒提取軟骨中的RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，用 Real-time PCR儀檢測(cè)Wnt5a、βcatenin、MMP-3、COL-Ⅱ的相對(duì)基因表達(dá)量，相關(guān)引物序列詳見表1。

用RipA裂解液裂解軟骨組織蛋白，BCA法檢測(cè)蛋白濃度，Western blot法檢測(cè) Wnt5a、βcatenin、MMP-3、COL-Ⅱ的蛋白表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。滿足正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，采用單因素ANOVA分析，2組間比較采用LSD法，對(duì)于分布非正態(tài)的數(shù)據(jù)，采用非參數(shù)檢驗(yàn)。

圖1 Wnt5a、β-catenin、MMP-3、COL-Ⅱ的相對(duì)蛋白表達(dá)量

2 結(jié)果

2.1 Real-time PCR結(jié)果

根據(jù)Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)結(jié)果，骨痹通方與正常組、模型組、鹽酸氨基葡糖組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。正常組與模型組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Wnt5a、β-catenin、MMP-3、COL-Ⅱ的相對(duì)基因表達(dá)量詳見表2。骨痹通方與正常組、模型組、鹽酸氨基葡糖組相比可以明顯抑制 Wnt5a、β-catenin、MMP-3 的基因表達(dá)（P＜0.05），促進(jìn) COL-Ⅱ的基因表達(dá)（P＜0.05）。模型組與正常組相比，可以顯著促進(jìn)Wnt5a、βcatenin、MMP-3 的基因表達(dá)（P＜0.05），減少 COL-Ⅱ的基因表達(dá)（P＜0.05）。

2.2 Western blot結(jié)果

根據(jù)Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)（圖1）可知，骨痹通方與模型組、鹽酸氨基葡萄糖組相比，可以顯著抑制 Wnt5a、β-catenin、MMP-3的蛋白表達(dá)（P＜0.05），骨痹通組與正常組、模型組、鹽酸氨基葡萄糖組相比可以明顯促進(jìn)COL-Ⅱ的蛋白表達(dá)（P＜0.05）。模型組、鹽酸氨基葡萄糖組與正常組相比，可以明顯促進(jìn) Wnt5a、βcatenin、MMP-3 的蛋白表達(dá)（P＜0.05），抑制 COL-Ⅱ的蛋白表達(dá)（P＜0.05）。 Wnt5a、β-catenin、MMP-3、COL-Ⅱ的相對(duì)蛋白表達(dá)量詳見圖1。

3 討論

3.1 中醫(yī)認(rèn)識(shí)“骨痹”及中藥干預(yù)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的相關(guān)研究

骨關(guān)節(jié)炎在中醫(yī)屬“骨痹”范疇，痹病之名首見于《黃帝內(nèi)經(jīng)》，《素問·痹論》云：“風(fēng)、寒、濕三氣雜至，合而為痹?！薄端貑枴け哉摗诽岢觥拔迮K皆有合，病久而不去者，內(nèi)舍于其合也。故骨痹不已，復(fù)感于邪，內(nèi)舍于腎”。可見，骨痹的發(fā)生與感受風(fēng)寒濕邪有關(guān)，骨痹日久，累及于腎，腎氣不足則骨痹愈重，因此治療骨痹，當(dāng)從補(bǔ)腎扶正論治，正氣足則可驅(qū)除外邪，疾病自愈。詹宏剛等人[4]用獨(dú)活寄生湯治療腎虛寒濕證膝骨關(guān)節(jié)炎，發(fā)現(xiàn)活寄生湯可以抑制 Wnt/β-catenin 信號(hào)通路中 Wnt5a、βcatenin、BMP-2mRNA表達(dá)，起到緩解骨關(guān)節(jié)炎疼痛的作用。肖志峰等人[5]通過模擬骨關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎活血方能夠抑制β-catenin的表達(dá)，減少致炎因子MMP-7、COMP等的含量，保護(hù)關(guān)節(jié)滑膜，減輕骨關(guān)節(jié)損傷。這些研究從多方面證實(shí)補(bǔ)腎中藥可以顯著抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白的表達(dá)，減少炎癥因子釋放，從而發(fā)揮對(duì)骨關(guān)節(jié)的保護(hù)作用。

3.2 Wnt/β-catenin信號(hào)通路及其對(duì)軟骨細(xì)胞凋亡的影響

研究顯示[6，7]，Wnt/β-catenin 信號(hào)通路是參與骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生和發(fā)展的重要通路，影響骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞分化、增殖和凋亡。骨關(guān)節(jié)炎患者體內(nèi)Wnt/β-catenin 信號(hào)通路呈激活狀態(tài)[8～10]，這主要是由于細(xì)胞外Wnt信號(hào)分子與細(xì)胞膜上特異性受體蛋白（frizzled）及輔助受體低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白（LRP5/6）結(jié)合后形成Fz-LRP5/6復(fù)合物結(jié)合散亂蛋白（Dvl）促進(jìn)LRP5/6磷酸化，促使軸蛋白（Axin）聚集到細(xì)胞膜抑制β-catenin磷酸化，穩(wěn)定的β-catenin移位到細(xì)胞核，聯(lián)合T細(xì)胞因子/淋巴增強(qiáng)因子（TCF/LEF）和聚集共激活劑，促使RNA轉(zhuǎn)錄和延伸。相反，當(dāng)Wnt-Fz-LRP5/6受體復(fù)合物形成受阻，支架蛋白Axin和腺瘤性結(jié)腸息肉病蛋白（APC）形成β-catenin破壞復(fù)合物，該復(fù)合物通過CK1和糖原合酶激酶-3β（GSK3β）結(jié)合胞內(nèi)β-catenin和促進(jìn)β-catenin的有序磷酸化，被β-Trcp識(shí)別和泛素化，通過蛋白酶體引起凋亡[11]。MMPs是Wnt/β-catenin信號(hào)通路的下游基因，同時(shí)也是破壞關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的主要酶類，當(dāng)Wnt/β-catenin信號(hào)通路被激活后會(huì)促進(jìn)MMPs的過表達(dá)[12]。基質(zhì)金屬蛋白酶大致可分為6類，其中基質(zhì)溶素酶（MMP-3、MMP-10及MMP-11）可以蛋白水解膠原等底物，造成基質(zhì)損傷[13]。Ⅱ型膠原蛋白是軟骨基質(zhì)的主要組成部分[14]。有研究表明[15]，當(dāng)MMP-3過表達(dá)時(shí)會(huì)直接破壞關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致OA的發(fā)生。這可能是由于MMP-3表達(dá)量升高引起軟骨基質(zhì)中Ⅱ型膠原蛋白的降解，最終導(dǎo)致軟骨破壞，加重骨關(guān)節(jié)炎。

3.3 骨痹通方通過抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路發(fā)揮保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨的作用

骨痹通方是首都國醫(yī)名師閻小萍教授治療骨關(guān)節(jié)炎的經(jīng)驗(yàn)方，方中骨碎補(bǔ)、補(bǔ)骨脂補(bǔ)肝腎、壯筋骨；淫羊藿、杜仲、狗脊補(bǔ)腎養(yǎng)溫陽作用較強(qiáng)，又兼有祛風(fēng)除濕強(qiáng)筋骨功效；青風(fēng)藤、雞血藤為藤類藥，性善走行，具有祛風(fēng)除痹、舒筋活血作用；土貝母苦寒開泄，制約溫補(bǔ)藥藥性過于猛烈。本研究通過研究骨痹通方干預(yù)大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨中wnt5a、β-catenin、MMP-3、COL-Ⅱ的基因及蛋白表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過骨痹通方干預(yù)的膝關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)軟骨中的 wnt5a、β-catenin、MMP-3基因表達(dá)量較正常組、模型組、鹽酸氨基葡萄糖組明顯下降（P＜0.05），而正常組、模型組、鹽酸氨基葡萄糖組的Ⅱ型膠原酶的基因表達(dá)量較骨痹通組明顯下降（P＜0.05），模型組、鹽酸氨基葡萄糖組 wnt5a、βcatenin、MMP-3的蛋白表達(dá)量較正常組明顯升高，Ⅱ型膠原酶的表達(dá)量明顯下降（P＜0.05）。骨痹通組較模型組、鹽酸氨基葡萄糖組wnt5a、βcatenin、MMP-3的蛋白表達(dá)量顯著降低，Ⅱ型膠原酶的蛋白表達(dá)量較正常組、模型組、鹽酸氨基葡萄糖組明顯升高（P＜0.05）。鹽酸氨基葡萄糖組的wnt5a、β-catenin、MMP-3、COL-Ⅱ的基因及蛋白表達(dá)量與模型組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05）。表明骨痹通方與鹽酸氨基葡萄糖相比，在治療骨關(guān)節(jié)炎上療效更為顯著。骨痹通方可以抑制膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠Wnt/β-catenin信號(hào)通路激活，減少M(fèi)MP-3表達(dá)，抑制COL-Ⅱ降解，從而發(fā)揮對(duì)骨關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)軟骨的保護(hù)作用。

根據(jù)本研究提出2點(diǎn)思考：（1）本研究初步證明骨痹通方對(duì)骨關(guān)節(jié)炎大鼠有治療作用，但最佳治療劑量有待進(jìn)一步探索。（2）骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，與許多影響因素相關(guān)，Wnt/β-catenin信號(hào)通路只是骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制中的一條，后期還需要大量研究發(fā)現(xiàn)骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生的具體機(jī)制。