周毅彬 王永昌 高鵬 朱進(jìn) 臧亞晨 許立軍 金露 馬麒

1蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院泌尿外科（江蘇蘇州215000）；2蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院超聲科（江蘇蘇州215000）

膀胱癌是全世界最常見的惡性腫瘤之一，2012年的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，當(dāng)年膀胱癌預(yù)計(jì)新發(fā)病例429 800 例，其中165 100 例患者因?yàn)榘螂装┒劳觯?］。膀胱癌主要發(fā)生在男性，且與吸煙密切相關(guān)。近些年來，由于吸煙人群的減少，歐美大多數(shù)國家膀胱癌的發(fā)病率有所降低［2］。另外，多進(jìn)食水果和蔬菜有助于減少膀胱癌的發(fā)生［3］。隨著醫(yī)學(xué)的進(jìn)步，出現(xiàn)了很多膀胱癌的治療方案，包括手術(shù)及術(shù)后化療和（或）放療，但是膀胱癌的致死率仍然很高。同時(shí)，術(shù)后放∕化療副作用大，患者往往難以耐受［4］。因此，研發(fā)有效且副作用低的新型化療藥成為當(dāng)前重要的研究課題之一。近十年來，植物提取劑因其潛在的抗腫瘤特性越來越受到研究者的關(guān)注，且目前批準(zhǔn)用于治療腫瘤的藥物中，有約70%為天然植物的提取成分［5］。葫蘆素E（cucurbitacin E，CuE）為葫蘆科植物的主要成分之一，研究發(fā)現(xiàn)其除了能抗氧化、抗炎外，還有很強(qiáng)的抗腫瘤能力［6］。CuE 能夠通過誘導(dǎo)凋亡、細(xì)胞周期阻滯和自噬性細(xì)胞死亡抑制包括卵巢癌和胰腺癌在內(nèi)多種腫瘤細(xì)胞的增殖，同時(shí)還能夠通過抑制多種信號(hào)通路抑制腫瘤血管新生［7-9］。研究報(bào)道CuE 能夠誘導(dǎo)G2∕M 周期阻滯和凋亡抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖［10］，CuE 是否能夠誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞發(fā)生自噬以及所誘導(dǎo)的自噬對(duì)細(xì)胞增殖是何影響，目前并不清楚。本研究旨在研究CuE 是否誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞T24 發(fā)生自噬，并進(jìn)一步闡述所誘導(dǎo)的自噬對(duì)細(xì)胞增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑 DMEM 培養(yǎng)基（購于美國Corning 公司），青霉素∕鏈霉素雙抗、BCA 蛋白定量試劑、PBS 和TBS（購自上海碧云天公司），無內(nèi)毒素胎牛血清（購自杭州四季青公司），CuE、MTT、BAFA1 和3-MA（購于美國Sigma 公司），脂質(zhì)體2000（購于美國賽默飛公司），LC3A∕B、p62 及GAPDH一抗和山羊抗兔及驢抗鼠二抗（購于美國CST 公司），GFP-RFP-LC3 質(zhì)粒和T24 細(xì)胞（西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科研究所饋贈(zèng)）［11］。細(xì)胞工作臺(tái)、細(xì)胞培養(yǎng)箱、電泳和轉(zhuǎn)膜儀（購于美國Biorad 公司）、熒光顯微鏡（購于日本Nikon 公司）等常用設(shè)備均由蘇州大學(xué)第二附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞的培養(yǎng)與處理 細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%青霉素∕鏈霉素雙抗的DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)基中。置于37 ℃、CO2濃度5%和濕度95%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔一天或按照需要實(shí)驗(yàn)需要換液。待細(xì)胞狀態(tài)良好呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)時(shí)，細(xì)胞經(jīng)PBS 洗2 次后0.25%胰酶消化、培養(yǎng)基中和后1 000 r∕min離心5 min。離心后的細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)基重懸后按照實(shí)驗(yàn)試講進(jìn)行種板等操作。

1.2.2 MTT 試驗(yàn)細(xì)胞 按3 000 個(gè)∕孔懸于200 μL培養(yǎng)基種于96 孔板中。次日換液，按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)的處理，每種處理設(shè)4 個(gè)副孔，放回細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。24 h 后每孔加入20 μL MTT，放回細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育。2～4 h 后棄去舊培養(yǎng)基并向每孔加入150 μL DMSO。微型振蕩器振蕩5 min，待藍(lán)紫色結(jié)晶完全溶解后于置于多功能酶標(biāo)儀中，于490 nm 波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光值。

1.2.3 Western-blot 將細(xì)胞從細(xì)胞培養(yǎng)箱取出后置于冰上，4 ℃預(yù)冷的PBS 洗3 次后加入RIPA裂解液。將懸有細(xì)胞的裂解液移至1.5 mL EP 管中，于冰上靜置5 min 使細(xì)胞充分裂解。4 ℃離心機(jī)12 000 r∕min 離心15 min 后棄去管底沉淀。取部分上清通過BCA 法定量，剩余上清加入4×上樣緩沖液，混合均勻后沸水煮5 min。取30 μg 蛋白加到10% SDS-PHAGE 膠孔中，經(jīng)電泳和轉(zhuǎn)膜后，使用5%脫脂牛奶對(duì)膜進(jìn)行封閉，4 ℃過夜或室溫孵育1 h。室溫孵育一抗2 h 或4 ℃過夜。TBST 洗3 次后室溫孵育二抗1 h，TBST 洗3 次后通過ECL法顯影。通過Image-J 軟件計(jì)算各條帶的灰度值。

1.2.4 CuE對(duì)T24自噬的影響與LC3翻轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞按500 000 個(gè)∕皿種于6 cm 皿中，共4 個(gè)皿，分別為對(duì)照組、CuE 組、BAFA1 組和CuE+BAFA1 組。次日換液，對(duì)照組和BAFA1 組更換為新鮮正常培養(yǎng)基，CuE 組和CuE+BAFA1 組更換為含有1 μmol∕L CUE 的培養(yǎng)基，放回細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。12 h后BAFA1組和CuE+BAFA1組加入濃度為10 nmol∕L的BAFA1。12 h 后提取總蛋白并通過western-blot檢測(cè)LC3A∕B、p62 和GAPHD 內(nèi)參的表達(dá)。

1.2.5 GFP-RFP-LC3 雙熒光試驗(yàn) 細(xì)胞按300 000 個(gè)∕孔種于6 孔板中，待細(xì)胞貼壁后按照脂質(zhì)體2000 的說明書進(jìn)行質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染操作。24 h 后消化細(xì)胞離心后按1 000 個(gè)∕孔種于腔室載玻片的小室中，共種2 個(gè)孔，分別為對(duì)照組和CuE 組，放回細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育過夜。次日換液。對(duì)照組加入含DMSO 的培養(yǎng)基，CuE 組加入終濃度為1 μmol∕L的培養(yǎng)基，細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。室溫PBS洗3 次后4%多聚甲醛固定10 min。PBS 洗3 次后將載玻片取出，滴加含DAPI 的封片液后封片，于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.6 細(xì)胞計(jì)數(shù)試驗(yàn) 細(xì)胞按300 000 個(gè)∕孔種于6 孔板中，設(shè)4 組，分別為對(duì)照組、CuE 組、3-MA 組和CuE+3MA 組，每組5 個(gè)孔。次日換液，對(duì)照組和CuE 組更換為新鮮正常培養(yǎng)基，3-MA 組和CuE+3MA組更換為含有5 mmol∕L3-MA的新鮮培養(yǎng)基。4 h 后，CuE 組和CuE+3MA 組加入CuE，使終濃度為1 μmol∕L，放回細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。24 h后消化并重懸于PBS，總體積為5 mL。使用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次且趨勢(shì)一致。使用GraphPad Prism 7.0 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)作圖并通過單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。以P＜0.05 視為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CuE抑制T24的增殖如圖1所示，0.25 μmol∕L 的CuE 對(duì)細(xì)胞的增殖無明顯影響，隨著濃度的增加，細(xì)胞的增殖逐漸被抑制，24 h 的IC50 約為0.75 μmol∕L。

圖1 CuE 對(duì)細(xì)胞增殖的影響Fig.1 Determined proliferation inhibition capacity of CuE on T24 By MTT

2.2 CuE 誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬 如圖2所示，CuE處理后自噬標(biāo)記物L(fēng)C3A∕B II表達(dá)升高（P＜0.05），LC3A∕B II∕I 的比值升高（P＜0.05），同時(shí)自噬的底物蛋白p62 表達(dá)減少（P＜0.05），提示自噬的發(fā)生。BAFA1 為經(jīng)典的自噬下游抑制劑，其處理后細(xì)胞LC3A∕B II 表達(dá)升高（P＜0.05），LC3A∕B II∕I 的比值升高（P＜0.05），當(dāng)CuE 與BAFA1 聯(lián)用時(shí)，LC3A∕B II 的表達(dá)和LC3A∕B II∕I 的比值進(jìn)一步升高（P＜0.05），說明LC3A∕B II 和LC3A∕B II∕I 比值的升高是因?yàn)樽允烧T導(dǎo)引起，而非阻斷自噬抑制LC3A∕B II 的降解引起，即CuE 誘導(dǎo)了自噬流的發(fā)生。

2.3 CuE 誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬流 為了進(jìn)一步證明CuE 誘導(dǎo)自噬流的發(fā)生，筆者進(jìn)行了GFP-RFP-LC3雙熒光試驗(yàn)。當(dāng)自噬體形成時(shí)，表現(xiàn)為綠色熒光顆粒，當(dāng)自噬體與溶酶體融合形成自噬溶酶體時(shí)，表現(xiàn)為黃色熒光顆粒。如圖3所示，CuE 處理后，黃色熒光顆粒和紅色熒光顆粒的數(shù)目均明顯增多（P＜0.05），進(jìn)一步說明了自噬流的發(fā)生。

2.4 3-MA抑制CuE誘導(dǎo)的自噬 3-MA為經(jīng)典的自噬抑制劑，能將自噬抑制在起始階段。如圖4所示，CuE能夠誘導(dǎo)自噬的發(fā)生，但是與3-MA（5 mmol∕L）聯(lián)用時(shí)，所誘導(dǎo)的自噬完全被抑制（P＜0.05）。

圖2 Western-blot 檢測(cè)CuE 對(duì)細(xì)胞自噬的影響Fig.2 Check the impacts of CuE treatment on autophagy by Western blot

2.5 3-MA 抑制自噬后CuE 對(duì)細(xì)胞增殖抑制效應(yīng)減弱 如圖5所示，在MTT 試驗(yàn)和細(xì)胞計(jì)數(shù)試驗(yàn)中，CuE 均能抑制細(xì)胞的增殖（P＜0.05），但是與3-MA 聯(lián)合用，CuE 對(duì)細(xì)胞增殖抑制的效應(yīng)明顯減弱（P＜0.05）。提示CuE 所誘導(dǎo)的自噬對(duì)細(xì)胞增殖起抑制作用。

3 討論

自噬為細(xì)胞新陳代謝調(diào)節(jié)的重要組成部分，對(duì)細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的平衡至關(guān)重要。當(dāng)細(xì)胞受到應(yīng)激時(shí)，細(xì)胞將激活一系列的信號(hào)通路誘導(dǎo)自噬的發(fā)生，將細(xì)胞內(nèi)多余的或受損傷的蛋白、細(xì)胞器和病原微生物來源的蛋白降解，為細(xì)胞供給營養(yǎng)，以維持細(xì)胞的正常功能［12］。研究報(bào)道CuE 在HeLa 細(xì)胞和MCF7 誘導(dǎo)自噬的發(fā)生［9］，但CuE 是否能誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞發(fā)生自噬，目前并不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，CuE 能夠顯著誘導(dǎo)人膀胱癌細(xì)胞T24 發(fā)生自噬，表現(xiàn)為L(zhǎng)C3A∕B2 的表達(dá)和LC3A∕B2∕1 比值的升高，同時(shí)自噬經(jīng)典底物蛋白p62 表達(dá)的減少。另外，LC-3 翻轉(zhuǎn)試驗(yàn)陽性以及GFP-RFP-LC3 熒光試驗(yàn)中黃色顆粒和紅色顆粒的明顯增多進(jìn)一步佐證了CuE 能夠在T24 中誘導(dǎo)自噬的發(fā)生。

自噬是把雙刃劍，其能通過為細(xì)胞提供營養(yǎng)維持或促進(jìn)細(xì)胞的正常增殖，如在膀胱癌的化療中，化療藥通過誘導(dǎo)自噬的發(fā)生削弱了化療藥的抗腫瘤增殖效應(yīng)，為腫瘤對(duì)化療藥耐藥的機(jī)制之一［13］；同時(shí)自噬也會(huì)通過降解重要細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)蛋白抑制細(xì)胞的增殖，如抑制G9a 的活性后能夠誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞發(fā)生自噬性細(xì)胞死亡［14］。CuE 所誘導(dǎo)的自噬對(duì)細(xì)胞增殖的影響，目前研究尚少。本研究發(fā)生，CuE 能夠抑制T24 細(xì)胞的增殖，同時(shí)誘導(dǎo)自噬的發(fā)生。當(dāng)自噬被抑制后，CuE 對(duì)T24 增殖抑制的能力減弱，提示CuE 所誘導(dǎo)的自噬對(duì)細(xì)胞的增殖起抑制作用。另外，自噬被抑制后CuE仍能部分抑制T24 的增殖，提示其可能誘導(dǎo)了凋亡或周期阻滯的發(fā)生。CuE 所誘導(dǎo)的自噬對(duì)凋亡或周期阻滯有何影響，尚不清楚，有待后續(xù)進(jìn)一步研究。

圖3 GFP-RFP-LC3 熒光試驗(yàn)檢測(cè)CuE 對(duì)細(xì)胞自噬的影響Fig.3 Determine autophagy flux by GFP-RFP-LC3 fluorescent assay

圖4 Western-blot 檢測(cè)3-MA 對(duì)自噬的抑制Fig.4 Check the autophagy inhibition ability of 3-MA on CuE treatment by Western blot

圖5 3-MA 抑制自噬后CuE 對(duì)細(xì)胞增殖的影響Fig.5 Influence of CuE-induced autophagy on cell proliferation with autophagy inhibition

在自噬發(fā)生過程中，細(xì)胞內(nèi)的雙膜結(jié)構(gòu)如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體等將細(xì)胞內(nèi)功能異常的細(xì)胞器、異常折疊的蛋白或病原等包裹形成自噬體，然后與溶酶體結(jié)合形成自噬溶酶體并最終降解。研究發(fā)現(xiàn)多種信號(hào)通路參與了自噬的調(diào)節(jié)，其中最為經(jīng)典的上游信號(hào)包括ROS、AMPK、ERK、PI3K 和DNA損傷等［12］。在肺癌中，CuE 通過調(diào)節(jié)ROS 的活性激活自噬的發(fā)生［15］；而在宮頸癌和乳腺癌中，CuE通過激活A(yù)MPK 并抑制mTOR 的功能誘導(dǎo)自噬的發(fā)生［9］。在膀胱癌中，CuE 所誘導(dǎo)的自噬是否與ROS 及AMPK 相關(guān)，目前并無研究。另外，其他信號(hào)通路如ERK、PI3K 和DNA 損傷等是否參與了CuE 對(duì)自噬的誘導(dǎo)，目前并不清楚。后續(xù)工作將對(duì)CuE 所誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞發(fā)生自噬的具體機(jī)制進(jìn)行研究。

綜上所述，CuE 在人膀胱癌細(xì)胞T24 中誘導(dǎo)了自噬的發(fā)生，且誘導(dǎo)的自噬對(duì)細(xì)胞的增殖起抑制作用。此研究為將來CuE 用于臨床治療膀胱癌提供了新的實(shí)驗(yàn)資料和理論基礎(chǔ)。