杜豆 周娟 邱英 馬灝川 紀(jì)佳朋 張為民

1廣州中醫(yī)藥大學(xué)研究生院（廣州510006）；2廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院腫瘤科（廣州510010）

肺癌是我國發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤［1］，其中非小細(xì)胞肺癌（non small cell lung cancer，NSCLC）約占80%［2］。在我國，表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）突變型占非小細(xì)胞肺癌約30%［3-4］。表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（EGFR-TKIs）已經(jīng)成為EGFR 突變陽性的晚期非小細(xì)胞肺癌首選治療方案［5］，但是大部分患者在經(jīng)過第一代EGFR-TKIs 治療10 ～12 個月后出現(xiàn)獲得性耐藥，EGFR 二次突變是獲得性耐藥的主要機制之一［6-8］。針對T790M 突變的第三代EGFR-TKIs 奧希替尼已被用于臨床，并取得了良好的療效。然而使用奧希替尼約在10 個月后仍無法避免地出現(xiàn)了獲得性耐藥，最終導(dǎo)致腫瘤進展［9-10］。目前，對于第三代EGFR-TKIs 耐藥后NSCLC 治療仍無合適的方案，化療仍是耐藥后NSCLC 的主要選擇，如何選擇最有效的化療藥物是臨床面臨的主要問題之一，遺憾的是目前缺乏基礎(chǔ)和臨床研究。本研究選用NSCLC 吉非替尼獲得性耐藥細(xì)胞株P(guān)C-9∕ZD，予以逐步遞增奧希替尼劑量法建立奧希替尼獲得性耐藥細(xì)胞株P(guān)C-9∕ZDOR，觀察其生物學(xué)特性和檢測其耐藥機制，并探討奧希替尼耐藥后對第三代肺癌化療藥物的敏感性，為研究奧西替尼耐藥機制提供了可靠的細(xì)胞模型，也為研究耐藥后NSCLC 選擇合適的化療藥物提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料 非小細(xì)胞肺癌PC-9∕ZD 細(xì)胞為吉非替尼獲得性耐藥細(xì)胞株由日本國立癌癥中心小泉史明博士惠贈，CCK-8 試劑購自日本同仁公司；RPMI-1640 培養(yǎng)基、北美血清購于美國Gibco 公司；二甲基亞砜購于MP 公司；EGFR、p-EGFR、Ecadherin、Vimentin、N-Cadherin 抗體購自美國CST公司，GAPDH 購自美國Affinity 公司，免疫印跡化學(xué)發(fā)光試劑ECL 購自美國Millipore 公司；奧希替尼購自美國SELLECK 公司；多西他賽、吉西他濱、培美曲塞、紫杉醇、順鉑、司美替尼購自MCE公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) PC-9∕ZD 細(xì)胞培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2條件下用含10%北美胎牛血清、1%青霉素、1%鏈霉素的RPMI-1640 培養(yǎng)液培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，實驗時收集生長狀態(tài)良好的對數(shù)生長期細(xì)胞進行實驗。

1.3 耐藥細(xì)胞株的建立 通過逐步增加藥物濃度的方法誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株P(guān)C-9∕ZD，取5 ×105個對數(shù)期的細(xì)胞于培養(yǎng)瓶中，貼壁24 h 后，予以0.1 μmol∕L 奧希替尼為初始濃度作用細(xì)胞，每日更換含藥培養(yǎng)基，初始可見細(xì)胞大量死亡，待3 ～4 周后細(xì)胞逐漸出現(xiàn)耐受穩(wěn)定生長后，予以普通培養(yǎng)基固定3 ～5 d 后傳代，再次倍增濃度直至循環(huán)6 個濃度周期，終止藥物濃度為3.2 μmol∕L，并在終濃度下維持1 個月后更換為無藥培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)1 個月，共歷時7 個月，完成整個培養(yǎng)過程，建立的耐藥細(xì)胞株被命名為PC-9∕ZDOR。于導(dǎo)置顯微鏡下對比觀察親本細(xì)胞株與耐藥細(xì)胞株的形態(tài)。

1.4 細(xì)胞EGFR 基因突變檢測 細(xì)胞消化離心后，棄上清液，加入1 mL PBS 吹打均勻，置于4 ℃冰盒中送廣州燃石醫(yī)學(xué)檢驗中心行NGS 技術(shù)檢測肺癌168 基因情況。

1.5 CCK-8 法檢測細(xì)胞的耐藥性 取對數(shù)生長期PC-9∕ZD 或PC-9∕ZDOR 單細(xì)胞懸液接種于96 孔板，3× 103個∕孔；培養(yǎng)24 h 后，加入含相應(yīng)濃度藥物的培養(yǎng)液200 μL∕孔，每個藥物濃度設(shè)5 個復(fù)孔，同時設(shè)空白組和無藥對照組；繼續(xù)培養(yǎng)72 h，仔細(xì)吸棄各孔培養(yǎng)液，每孔加入RPMI1640 培養(yǎng)基100 μL 和CCK-8 試劑10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)1 h；在酶聯(lián)免疫檢測儀上于450 nm 波長下檢測各孔的吸光度值，采用Graphpad Prism 6.0 軟件計算各組細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度，再按此公式計算耐藥指數(shù)（RI）。RI=IC50（PC-9∕ZDOR）∕IC50（PC-9∕ZD）。

1.6 細(xì)胞生長曲線的繪制和倍增時間計算 取對數(shù)生長期的細(xì)胞PC-9∕ZD、PC-9∕ZDOR 細(xì)胞分別接種96 孔板，1 × 103∕孔，每種細(xì)胞設(shè)5 個復(fù)孔，孵育1、2、3、4、5、6 和7 d 后進行細(xì)胞增殖檢測，Graphpad Prism 6.0 繪制細(xì)胞生長曲線，計算細(xì)胞倍增時間。

1.7 Western blot 分析細(xì)胞中EGFR 及相關(guān)蛋白表達(dá) 細(xì)胞中加入蛋白裂解液、置于冰上裂解后提取蛋白，并用BCA 法測定蛋白濃度，等量上樣后行8%SDS-PAGE 電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，封閉，加入相應(yīng)的一抗4 ℃孵育過夜，用TBST 搖床洗膜3 次，選擇相應(yīng)的二抗室溫?fù)u床反應(yīng)1 h，再用TBST 洗膜3 次，最后用ECL 顯色并采用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)成像。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用Graphpad Prism 6.0 統(tǒng)計軟件進行分析數(shù)據(jù)和作圖，數(shù)據(jù)結(jié)果用表示。采用t檢驗比較兩組間數(shù)據(jù)，單因素方差分析比較多組間數(shù)據(jù)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。以上實驗數(shù)據(jù)均重復(fù)3 次。

2 結(jié)果

2.1 PC-9/ZDOR 耐藥細(xì)胞株的建立 歷時7 個月成功將PC-9∕ZD 細(xì)胞體外誘導(dǎo)成奧希替尼獲得性耐藥細(xì)胞株，命名為PC-9∕ZDOR。洗脫奧希替尼后6 個月，CCK-8 法檢測親本細(xì)胞及耐藥細(xì)胞株對奧希替尼的IC50值，結(jié)果顯示較親本細(xì)胞PC-9∕ZD，耐藥細(xì)胞株P(guān)C-9∕ZDOR 對奧希替尼的敏感性顯著下降，IC50值分別為（0.08 ± 0.15）和（3.52 ± 0.03）μmol∕L（P＜0.05），RI 為44（圖1）。

2.2 耐藥細(xì)胞株的EGFR 基因變化 采用NGS 技術(shù)檢測PC-9∕ZD 細(xì)胞結(jié)果顯示為EGFR p.E746_A750del伴隨T790M及EGFR amp，耐藥細(xì)胞株P(guān)C-9∕ZDOR 結(jié)果顯示EGFR p.E746_A750del 及T790M 均消失，無其他EGFR 基因表達(dá)也無EGFR 擴增。

圖1 PC-9∕ZD 和PC-9∕ZDOR 的奧希替尼藥物濃度-細(xì)胞存活率曲線Fig.1 The cell viability of osimertinib in PC-9∕ZD and PC-9∕ZDOR cells

2.3 細(xì)胞生長曲線及腫瘤倍增時間 細(xì)胞生長曲線顯示，兩種細(xì)胞增殖無明顯差異。PC-9∕ZD 細(xì)胞倍增時間為（35.44 ± 0.77）h，PC-9∕ZDOR 細(xì)胞倍增時間為（37.99±2.14）h（P＞0.05，圖2）。

圖2 PC-9∕ZD 和PC-9∕ZDOR 細(xì)胞的生長曲線Fig.2 The proliferation ability of PC-9∕ZD and PC-9∕ZDOR cells

2.4 細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化 在倒置顯微鏡下PC-9∕ZD、PC-9∕ZDOR 細(xì)胞均為貼壁生長。PC-9∕ZD 細(xì)胞呈長梭形和圓形為主，長偽足，排列無規(guī)則。而PC-9∕ZDOR 細(xì)胞相互鑲嵌，呈團簇樣生長，細(xì)胞較為扁平，體積稍變小變圓（圖3）。

2.5 耐藥細(xì)胞株EMT 標(biāo)志蛋白、EGFR、p-ERK及p-AKT 蛋白表達(dá)變化 與親本細(xì)胞比較，耐藥細(xì)胞株P(guān)C-9∕ZDOR 細(xì)胞的EGFR 及其磷酸化蛋白表達(dá)顯著減少（P＜0.05），E-Cadherin 和N-Cadherin的蛋白表達(dá)量明顯減少（P＜0.05），間質(zhì)標(biāo)志Vimentin 的蛋白表達(dá)量未見增加（P＞0.05）。p-ERK和p-AKT 蛋白表達(dá)水平明顯下降（P＜0.05），AKT和ERK 蛋白表達(dá)無明顯改變（P＞0.05，圖4）。

圖3 PC-9∕ZD 和PC-9∕ZDOR 細(xì)胞的形態(tài)差異Fig.3 The morphological differences between PC-9∕ZD and PC-9∕ZDOR cells

圖4 western blot 檢測PC-9∕ZD 和PC-9∕ZDOR 細(xì)胞的相關(guān)蛋白表達(dá)Fig.4 The expressions of relative proteins in PC-9∕ZD 和PC-9∕ZDOR cells

2.6 細(xì)胞獲得性耐藥后對不同化療藥物敏感性與親本細(xì)胞相比，耐藥細(xì)胞株P(guān)C-9∕ZDOR 對化療藥物多西他賽、吉西他濱、紫杉醇敏感性增加（P＜0.05），而對培美曲塞、順鉑的敏感性無明顯變化（P＞0.05，表1）。

表1 PC-9∕ZD 細(xì)胞和PC-9∕ZDOR 細(xì)胞的藥物敏感性Tab.1 The sensitivity of themotherapeuticdrugs in PC-9∕ZD and PC-9∕ZDOR cell line（n=3） ±s

表1 PC-9∕ZD 細(xì)胞和PC-9∕ZDOR 細(xì)胞的藥物敏感性Tab.1 The sensitivity of themotherapeuticdrugs in PC-9∕ZD and PC-9∕ZDOR cell line（n=3） ±s

藥物多西他賽吉西他濱培美曲賽紫杉醇順鉑IC50（nmol∕L）PC-9∕ZD 0.476±0.067 21.257±1.059 51.890±6.698 2.205±0.225＞100 000 PC-9∕ZDOR 0.074±0.021 7.878±0.478 55.233±1.341 1.203±0.341＞100 000耐藥指數(shù)0.154 0.371 1.064 0.545-

3 討論

本研究選取的NSCLC PC-9∕ZD 細(xì)胞株為吉非替尼獲得性耐藥細(xì)胞株［11］，二代測序證實為19 外顯子突變合并T790M 突變耐藥細(xì)胞株，通過體外遞增藥物濃度的方法建立奧希替尼獲得性耐藥細(xì)胞株P(guān)C-9∕ZDOR，其RI 為44，在停止給藥6 個月后耐藥細(xì)胞株仍保持相似耐藥性，提示體外國內(nèi)首次成功建立伴T790M 突變一代EGRF-TKI 耐藥后三代EGRF-TKI 耐藥細(xì)胞模型。

進一步對本研究中耐藥細(xì)胞株P(guān)C-9∕ZDOR 進行NGS 檢測分析EGFR 基因突變及Western blot 檢測EGFR 蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，與親本細(xì)胞相比，原EGFR 基因突變（p.E746_A750del 和T790M）消失，無EGFR 擴增及其他新的EGFR 相關(guān)基因突變。PC-9∕ZDOR 細(xì)胞株EGFR 及其磷酸化蛋白表達(dá)呈顯著減少，其下游信號p-ERK 和p-AKT 蛋白表達(dá)水平明顯下降。結(jié)果表明EGFR 靶點的丟失可能是第三代EGFR-TKIs 獲得性耐藥的主要機制之一，與國外報道一致。KIM 等［12］研究發(fā)現(xiàn)，吉非替尼耐藥后出現(xiàn)T790M 突變后服用奧希替尼后變?yōu)镋GFR 野生型。MIZUUCHI 等［13］的研究中也報道HCC827∕ER 厄洛替尼耐藥細(xì)胞株（19del+T790M+EGFR amp）經(jīng)EGFR T790M 抑制劑CNX2006 處理后，出現(xiàn)EGFR 擴增消失的情況。THRESS 等［14］的研究中報道患者在奧希替尼獲得性耐藥后T790M突變消失。這些結(jié)果表明EGFR 靶點的丟失導(dǎo)致臨床獲得性耐藥性產(chǎn)生后繼續(xù)應(yīng)用EGFR-TKIs 治療效果不佳。

已報道的第三代EGFR-TKIs 的耐藥機制除T790M 減少或消失［14］、EGFR 新發(fā)突變（C797S、L718Q、G796R 等）［14-16］、旁路信號途徑激活［12，17-18］外，還與細(xì)胞出現(xiàn)EMT 表型有關(guān)［19］。本研究中與親本細(xì)胞PC-9∕ZD 相比，耐藥細(xì)胞PC-9∕ZDOR 中的上皮標(biāo)志物E-Cadherin 和N-Cadherin 的蛋白表達(dá)量明顯減少，但間質(zhì)標(biāo)志Vimentin 的蛋白表達(dá)量未見增加。說明耐藥細(xì)胞株P(guān)C-9∕ZDOR并未出現(xiàn)EMT。

化療是目前第三代EGFR-TKIs 耐藥進展患者的主要治療方法之一，本研究發(fā)現(xiàn)與親代PC-9∕ZD細(xì)胞相比，PC-9∕ZDOR 細(xì)胞株對化療藥物多西他賽、吉西他濱、紫杉醇敏感性增高，而對培美曲塞、順鉑敏感性無明顯變化。TANG 等［20］的體外研究結(jié)果也提示對奧希替尼耐藥細(xì)胞株H1975∕OSIR表現(xiàn)出對紫杉醇的敏感性增高，而對培美曲賽的敏感性無變化，與本研究結(jié)果一致。KIM 等［12］的臨床研究亦顯示奧希替尼進展的患者對紫杉醇的高敏感性。本研究和既往研究結(jié)果提示對奧希替尼耐藥的肺癌對紫杉類化療較敏感，對臨床晚期NSCLC 經(jīng)奧希替尼治療后進展的患者選擇合適的化療藥物有一定參考意義，但仍需進一步多中心臨床研究來證實。本研究結(jié)果還提示奧希替尼耐藥的PC-9∕ZDOR 細(xì)胞株對吉西他濱敏感，目前國內(nèi)外未見無類似報道，仍需擴大研究來證實。

綜上所述，本研究通過奧希替尼逐步遞增劑量，國內(nèi)首次成功誘導(dǎo)伴T790M 突變的一代EGRF-TKI 耐藥后三代EGRF-TKI 耐藥細(xì)胞模型，發(fā)現(xiàn)其耐藥機制可能與EGFR 基因突變消失和（或）EGFR 及其磷酸化蛋白表達(dá)顯著減少、EGFR 信號蛋白p-ERK 和p-AKT 減少有關(guān)，耐藥后細(xì)胞株對紫杉類、吉西他濱化療藥物敏感性增加。本研究為研究奧西替尼耐藥機制提供了可靠的細(xì)胞模型，也為臨床治療三代EGRF-TKI 耐藥方案的選擇提供參考依據(jù)。鑒于本研究只采用一個細(xì)胞株，未能全面概括不同亞型細(xì)胞對奧西替尼的耐藥機制，結(jié)果有待進一步擴大研究并在臨床加以證實。