沈智君， 張迅軼， 楊 峰， 楊 敏， 陳子昂， 紀(jì)亞忠

(同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，上海 200065)

自1983年世界首例凍融胚胎移植試管嬰兒獲得成功妊娠以來，冷凍胚胎移植(frozen-thawed embryo transfer, FET)技術(shù)作為體外受精-胚胎移植的常規(guī)治療技術(shù)之一，已廣泛應(yīng)用于人類輔助生殖技術(shù)領(lǐng)域。FET在預(yù)防卵巢過度刺激綜合征(ovarian hyperstimulation syndrome, OHSS)的發(fā)生、提高累積妊娠率、減少促排卵次數(shù)、降低異位妊娠風(fēng)險(xiǎn)等方面具有重要意義，而影響FET妊娠率的主要因素包括年齡、臨床用藥方案、胚胎質(zhì)量、子宮內(nèi)膜的容受性以及胚胎與子宮內(nèi)膜的同步化等，其中胚胎質(zhì)量是決定FET成功的重要環(huán)節(jié)之一[1-2]。另外，F(xiàn)ET的實(shí)施方案可分為當(dāng)天解凍并移植以及解凍后培養(yǎng)18～20h后移植，并按照指南的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)解凍后及過夜培養(yǎng)后的胚胎質(zhì)量進(jìn)行評(píng)分[3]。本研究通過觀察胚胎解凍并過夜培養(yǎng)18～20h后卵裂球的增殖情況，計(jì)算卵裂球的增殖比例，分組進(jìn)行分析及探討其與FET妊娠結(jié)局的相關(guān)性，以期為判斷胚胎的發(fā)育潛能及臨床妊娠結(jié)局提供更多的參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2015年1月—2016年12月在同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科行FET的周期，納入研究的臨床及實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)為： (1) 女方因盆腔輸卵管、排卵障礙、子宮內(nèi)膜異位癥等因素，或免疫因素、不明原因等不孕，以及男方因少、弱、畸精或無精癥等因素不育；(2) 所有內(nèi)膜準(zhǔn)備方案均為人工周期的冷凍胚胎移植周期；(3) 所有解凍移植的胚胎均為授精后72h的第3天(D3)卵裂期胚胎；(4) 解凍后培養(yǎng)時(shí)間為18～20h；(5) 2枚胚胎均解凍后均有≥50%的卵裂球存活的復(fù)蘇胚胎；培養(yǎng)后均有卵裂球增殖或與解凍后卵裂球數(shù)量相同，無逆分裂或卵裂球數(shù)少于解凍后現(xiàn)象；2枚胚胎均予以移植。

1.2 方法

1.2.1 內(nèi)膜準(zhǔn)備及移植 均采用人工周期進(jìn)行移植前內(nèi)膜準(zhǔn)備。月經(jīng)周期第2～3天行陰道超聲，根據(jù)患者基礎(chǔ)內(nèi)分泌激素和內(nèi)膜情況采用戊酸雌二醇行人工周期治療，黃體酮轉(zhuǎn)化內(nèi)膜3d后移植。

1.2.2 玻璃化冷凍、解凍及胚胎培養(yǎng) 使用Origio玻璃化冷凍試劑盒(MEDICULT，丹麥)對(duì)D3卵裂期胚胎進(jìn)行冷凍。該試劑盒包括平衡液和玻化液，所有操作于室溫進(jìn)行，將胚胎置于平衡液中，胚胎經(jīng)歷從皺縮到重新擴(kuò)張的過程，大約5min后轉(zhuǎn)移至?；?，并在1min內(nèi)裝載于載桿前端，立即投入液氮保存。在擬移植時(shí)間的前18～20h解凍胚胎，使用Origio玻璃化解凍試劑盒對(duì)D3卵裂期胚胎進(jìn)行解凍。該試劑盒包括解凍液、稀釋液1、稀釋液2及洗滌液，將胚胎從液氮中取出，置于37℃的解凍液中，隨后每隔3min依次將胚胎轉(zhuǎn)移至室溫的稀釋液1、稀釋液2及洗滌液中，最后轉(zhuǎn)入37℃的含人血清替代品(Synthetic Serum Substitute Irvine，美國)的胚胎培養(yǎng)液(Continuous Single Culture， Irvine，美國)中繼續(xù)培養(yǎng)18～20h，培養(yǎng)環(huán)境為37℃、5% CO2及5% O2(ASTEC 30L三氣培養(yǎng)箱，ASTEC，日本)。

1.2.3 胚胎分級(jí)評(píng)估及卵裂球增殖計(jì)算方式 結(jié)合伊斯坦布爾胚胎評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)及中心實(shí)驗(yàn)室經(jīng)驗(yàn)，根據(jù)卵裂球數(shù)、碎片量、卵裂球大小均一性等對(duì)所有納入研究的胚胎進(jìn)行冷凍前、解凍后及培養(yǎng)后的評(píng)級(jí)[3]。I級(jí)胚胎： 7～9細(xì)胞，卵裂球大小均勻，碎片<5%，無空泡；Ⅱ級(jí)胚胎： ≥6細(xì)胞，卵裂球大小均勻或大致均勻，碎片5%～10%，無或有少量空泡；Ⅲ級(jí)胚胎： ≥5細(xì)胞，卵裂球大小不均勻，碎片10%～20%，可有空泡；Ⅳ級(jí)胚胎： ≤4細(xì)胞或碎片>20%，卵裂球大小不均勻。另外，使用公式[(培養(yǎng)后卵裂球數(shù)量-解凍后卵裂球數(shù)量)/解凍后卵裂球數(shù)量]×100%，計(jì)算胚胎培養(yǎng)后卵裂球的增殖百分率。

1.2.4 胚胎分組 本項(xiàng)研究分析了納入統(tǒng)計(jì)周期的女方患者年齡、不孕年限、BMI、移植日內(nèi)膜厚度及復(fù)蘇胚胎繼續(xù)培養(yǎng)的胚胎增殖情況，其中胚胎增殖分組： (1) 根據(jù)移植的2枚胚胎卵裂球是否增殖，分為0枚生長(zhǎng)組(S0)；1枚生長(zhǎng)組(S1)及2枚生長(zhǎng)組(S2)。(2) 在2枚生長(zhǎng)組(S2)中，根據(jù)卵裂球增殖情況或增殖百分比。分為a組： 增殖形成桑葚胚或早期囊胚；b組： 卵裂球增殖率≥50%；c組： 50%>卵裂球增殖率≥25%；d組： 卵裂球增殖率<25%，移植2枚胚胎，則分為aa、ab、ac、ad、bb、bc、bd、cc、cd、dd共10組。

1.2.5 確定妊娠及隨訪 移植后12d檢測(cè)血β-hCG，若血β-hCG>5 IU/L提示生化妊娠，48h后復(fù)查翻倍情況，若翻倍良好則繼續(xù)黃體支持；若血β-hCG<5 IU/L，則停藥待月經(jīng)。移植后28d陰道超聲檢查，見孕囊、胚芽、心管搏動(dòng)者確定為臨床妊娠，繼續(xù)黃體支持至妊娠10～12周，并隨訪至活產(chǎn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 一般臨床結(jié)果

本研究經(jīng)納入條件篩選，共選取991個(gè)FET周期，女性患者平均年齡為(32.90±6.25)歲，臨床妊娠周期424個(gè)，臨床妊娠率(臨床妊娠周期/周期數(shù))42.79%；移植胚胎1982枚，孕囊數(shù)535個(gè)，胚胎種植率(孕囊數(shù)/移植胚胎數(shù))26.99%；多胎妊娠75例，多胎妊娠率(多胎妊娠周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù))17.69%；流產(chǎn)率(流產(chǎn)周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù))28.3%。年齡在各個(gè)分組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 培養(yǎng)后2枚胚胎卵裂球是否增殖與妊娠結(jié)局的關(guān)系

胚胎解凍經(jīng)18～20h培養(yǎng)后移植，S2組的臨床妊娠率和胚胎種植率顯著高于S1組(P<0.01)，而S1組又顯著高于S0組(P<0.01)；同時(shí)，S1組的流產(chǎn)率顯著高于S2組(P<0.01)；另外，S2組的多胎妊娠率顯著高于S1組(P<0.01)，見表1。

表1 培養(yǎng)后胚胎卵裂球是否增殖與妊娠結(jié)局的關(guān)系

與S1組相比，*P<0.01；與S0組相比，#P<0.01。

2.3 培養(yǎng)后2枚胚胎卵裂球的增殖情況或增殖百分比與妊娠結(jié)局的關(guān)系

在胚胎解凍培養(yǎng)后移植的S2組中，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)妊娠率的變化趨勢(shì)分為3個(gè)區(qū)段，第一個(gè)區(qū)段(A區(qū)段)包含aa、ab、ac、ad組；第二個(gè)區(qū)段(B區(qū)段)包含bb、bc、bd組；第三個(gè)區(qū)段(C區(qū)段)包含cc、cd、dd組，此3個(gè)區(qū)段的妊娠率分別隨著各組內(nèi)2枚胚胎中另一枚卵裂球增殖比例的降低而降低，其妊娠率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，；另外，3個(gè)區(qū)段的平均妊娠率之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表2。

表2 培養(yǎng)后胚胎卵裂球的增殖情況或增殖比例與妊娠結(jié)局的關(guān)系

(續(xù)表2)

與aa組相比，*P<0.01；與bb組相比，#P<0.01；與cc組相比，△P<0.05。

2.4 Logistic分析結(jié)果

將本項(xiàng)研究納入的其他參數(shù)，即采卵時(shí)女方年齡、體質(zhì)量指數(shù)(body mass index, BMI)、不孕年限及移植日內(nèi)膜厚度作Logistic分析，結(jié)果提示女方年齡與妊娠顯著相關(guān)(P<0．05)，見表3。

表3 與臨床妊娠相關(guān)的多因素Logistic回歸分析結(jié)果

3 討 論

隨著胚胎玻璃化冷凍技術(shù)的日益成熟，玻璃化冷凍的胚胎復(fù)蘇率可達(dá)98%以上，使冷凍胚胎移植的妊娠率得到極大的提高[4]。影響胚胎種植的因素很多，其中胚胎質(zhì)量是影響移植成功率非常重要的因素之一[5]。按照指南，胚胎質(zhì)量可以從卵裂球數(shù)量、胚胎碎片、卵裂球均一性等角度進(jìn)行評(píng)判，而與胚胎發(fā)育天數(shù)相符合的卵裂球數(shù)量又是影響胚胎質(zhì)量評(píng)分的重要依據(jù)[3]。在FET操作中，延長(zhǎng)解凍后胚胎的培養(yǎng)時(shí)間，可進(jìn)一步觀察其發(fā)育潛能[6]，目前對(duì)于培養(yǎng)后胚胎質(zhì)量的評(píng)價(jià)依然使用指南的靜態(tài)標(biāo)準(zhǔn)，缺乏反映其發(fā)育潛能的動(dòng)態(tài)指標(biāo)(如培養(yǎng)前后發(fā)育情況對(duì)比)，很難對(duì)培養(yǎng)后胚胎的發(fā)育潛能作出客觀的評(píng)判及進(jìn)一步的移植胚胎選擇。本研究從培養(yǎng)后卵裂球數(shù)目的客觀依據(jù)出發(fā)，計(jì)算出培養(yǎng)前后胚胎卵裂球增殖的比例，分析該比例與妊娠結(jié)局的關(guān)系。

所有解凍的胚胎均為受精后72h的卵裂期胚胎，在其繼續(xù)生長(zhǎng)的18～20h內(nèi)有較明確的增殖狀態(tài)或者卵裂球增殖數(shù)目等客觀指標(biāo)；納入研究的解凍后胚胎均為有≥50%卵裂球存活的復(fù)蘇胚胎，若有>50%卵裂球凋亡或溶解則判定為復(fù)蘇失敗，或培養(yǎng)后若出現(xiàn)逆分裂(reverse cleavage)或卵裂球數(shù)少于解凍后的情況，通常該情況會(huì)取消移植[7]。

本研究發(fā)現(xiàn)移植2枚胚胎均有卵裂球增殖的移植組(S2組)，其種植率、妊娠率均明顯高于只有1枚發(fā)育胚胎的移植組(S1組)和無卵裂球增殖組(S0組)，且流產(chǎn)率明顯低于S1及S0組；提示對(duì)復(fù)蘇后胚胎進(jìn)一步培養(yǎng)觀察卵裂球是否增殖，對(duì)臨床冷凍復(fù)蘇周期的胚胎選擇具有參考意義。研究從解凍培養(yǎng)后胚胎卵裂球增殖比例的角度出發(fā)，發(fā)現(xiàn)臨床結(jié)局的變化趨勢(shì)明顯分為三個(gè)區(qū)段，在移植的2枚胚胎中至少有1枚發(fā)育到早期囊胚階段的A區(qū)段，無論與其一起移植的另一枚胚胎發(fā)育情況如何，均能獲得理想的臨床妊娠率及較低的流產(chǎn)率，提示了單囊胚移植的可行性；在移植的2枚胚胎中有1枚的卵裂球增值率>50%而未達(dá)到早期囊胚階段，另一枚增值率較其更低的B區(qū)段，也能獲得較好的臨床妊娠率，然而流產(chǎn)率卻隨著另一枚胚胎卵裂球增值率的下降而有所升高；最后，在移植的2枚胚胎中至少有1枚的卵裂球增值率在25%和50%之間或者<25%，另一枚增值率較其更低的C區(qū)段，臨床妊娠率進(jìn)一步降低，在dd組，流產(chǎn)率甚至可高達(dá)50%。有研究[8]表明，人類胚胎在基因組激活主要發(fā)生在受精后發(fā)育第3天，在胚胎基因組激活后開始致密化形成桑葚胚，故復(fù)蘇24h仍無卵裂球增殖或低增值率的胚胎，其染色體異常率可達(dá)80%以上，這可能是本研究中流產(chǎn)率隨著胚胎卵裂球增殖率的下降而增高的原因。

由此可見，解凍后經(jīng)培養(yǎng)18～20h的胚胎發(fā)育情況與妊娠結(jié)局相關(guān)，但還需增加樣本量來進(jìn)一步研究論證。冷凍復(fù)蘇后的胚胎若能恢復(fù)胚胎良好的發(fā)育狀態(tài)，則預(yù)示其有較好的臨床結(jié)局。所以，通過延長(zhǎng)體外培養(yǎng)時(shí)間，評(píng)估胚胎卵裂球的增值潛能，篩選出較優(yōu)質(zhì)胚胎，為臨床結(jié)局提供參考。