張 昊，馮佳佳，孫丹丹，閆青地，趙亞林，王 珊，王平平，趙亞卓，王 倩，王鳳茹，董金皋

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北省植物生理和分子病理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 保定 071001)

莖腐病是造成玉米倒伏減產(chǎn)的主要病害[1-4]，禾谷鐮孢(Fusariumgraminearum)是引起莖腐病的主要病原真菌[5-7]，在國(guó)家推行綠色生產(chǎn)方式、農(nóng)業(yè)部提出“農(nóng)藥化肥雙減”和“農(nóng)藥零增長(zhǎng)”的概念和目標(biāo)下，本研究把國(guó)際上公認(rèn)的高效、廣譜、無(wú)毒的植物激素油菜素內(nèi)酯(BR，Brassinosteroid)作為研究對(duì)象，明確BR對(duì)禾谷鐮孢生長(zhǎng)發(fā)育的影響及提高玉米抗禾谷鐮孢侵染的作用機(jī)制，為BR在玉米抗莖腐病和抗倒伏方面的高效利用提供理論依據(jù)和技術(shù)參考。禾谷鐮孢又稱(chēng)禾谷鐮刀菌，禾谷鐮孢能侵染玉米等禾谷類(lèi)作物的莖、莖基部和根部等部位，引起莖腐、莖基腐和根腐病等病害[6]。禾谷鐮刀菌侵染玉米后，快速生出白色絨狀或絮狀菌絲，由白色逐步變至玫瑰色、粉紅色或磚紅色[7]。莖腐病是由單個(gè)病原菌或多個(gè)病原菌復(fù)合侵染造成莖基腐爛的一類(lèi)病害，主要由鐮刀真菌侵染引起，鐮刀菌生長(zhǎng)的最適溫度為25～26 ℃，其生長(zhǎng)條件要求濕度較低，因此，在干旱地區(qū)(如我國(guó)西北部地區(qū))以鐮刀菌型莖基腐為主[8]。土壤肥沃，有機(jī)質(zhì)豐富，排灌條件良好的地區(qū)，玉米生長(zhǎng)健壯，發(fā)病輕；土壤瘠薄，排水條件差，玉米生長(zhǎng)較弱，發(fā)病重[9]。BR對(duì)可改良株型[10-12]、促進(jìn)根系生長(zhǎng)[13-15]、提高抗逆性[16-18]、降低農(nóng)藥殘留[19-20]、提高植物的抗病性且具有廣譜性[21]。已有研究表明，BR可提高玉米的光合性能[22]、提高玉米葉片捕光能力[23]、CO2的固定能力[22,24]、促進(jìn)光合產(chǎn)物的積累和運(yùn)輸[25-26]，但BR對(duì)禾谷鐮孢生長(zhǎng)發(fā)育的影響及BR提高玉米抗禾谷鐮孢菌侵染的具體機(jī)制尚不明確。

本研究從BR對(duì)病原菌和對(duì)寄主玉米兩方面的影響作為切入點(diǎn)，探討B(tài)R提高玉米抗禾谷鐮孢菌侵染的機(jī)制。旨在明確BR對(duì)玉米莖腐病病原菌禾谷鐮孢生長(zhǎng)發(fā)育的影響，深化BR提高玉米抗侵染的機(jī)制，為“農(nóng)藥化肥雙減”和“農(nóng)藥零增長(zhǎng)”的推行提供技術(shù)支持。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試玉米品種是鄭單958，購(gòu)于市場(chǎng)。禾谷鐮孢由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)真菌毒素與植物分子病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

玉米的培養(yǎng)條件為28 ℃、12 h光照，20 ℃、12 h黑暗。 試驗(yàn)所用油菜素內(nèi)酯為人工合成的2,4-表油菜素內(nèi)酯(2,4-Epicastasterone, 2,4-eBL)。采用葉面噴施的方法，在玉米八葉期葉面噴施前期預(yù)試驗(yàn)選定的2,4-eBL濃度為100 nmol/L，每株20 mL，全株均勻噴施。噴施BR后10 d，在玉米莖基部第2節(jié)用注射的方法接種禾谷鐮孢，并設(shè)不接種禾谷鐮孢的對(duì)照進(jìn)行觀測(cè)和分析。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.3.1 禾谷鐮孢接種玉米方法 活化的禾谷鐮孢加入適量無(wú)菌水，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算孢子數(shù)目，孢子懸浮液的數(shù)目達(dá)到106個(gè)/mL即可用于侵染玉米莖部。用5 mL注射器注射至玉米基本第2個(gè)莖節(jié)中部，每個(gè)莖節(jié)接種5 mL。

1.3.2 禾谷鐮孢的培養(yǎng)及觀察 將禾谷鐮孢接種到含0，10，1 000 nmol/L的PDA 培養(yǎng)基中，25 ℃黑暗培養(yǎng) 5 d。用打孔器(直徑 5 mm)取菌落邊緣的菌絲瓊脂塊，然后將禾谷鐮孢菌絲塊接種，培養(yǎng) 3 d 后測(cè)量禾谷鐮孢菌落面積，每個(gè)處理重復(fù) 3 次，觀察禾谷鐮孢的生長(zhǎng)情況。

1.3.3 禾谷鐮孢侵染玉米的觀測(cè) 取接種禾谷鐮孢后生長(zhǎng)20 d后的玉米莖節(jié)，縱向剖開(kāi)，觀察玉米發(fā)病情況。

1.3.4 玉米株型的觀測(cè) 于成熟期, 選取不同處理群體生長(zhǎng)一致的10株, 選定主莖, 測(cè)定最上面葉的長(zhǎng)、寬、葉基角(葉片基部與莖稈的夾角)、葉干質(zhì)量。

1.3.5 玉米保護(hù)酶活性的檢測(cè) 過(guò)氧化物酶(Peroxidase，POD)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)和PAL(苯丙氨酸解氨酶)活性測(cè)定參照路文靜等[27]的方法進(jìn)行。

1.3.6 玉米抗倒伏能力測(cè)定 利用 YYD1B 數(shù)顯植物莖稈強(qiáng)度檢測(cè)儀對(duì)玉米進(jìn)行莖稈抗倒伏強(qiáng)度測(cè)定，具體方法為用橡皮條將植物莖稈強(qiáng)度檢測(cè)儀前端附件與玉米莖稈1/2 處固定， 在莖稈與地面呈直角的情況下輕推玉米莖稈，待玉米莖稈傾斜到與地面呈45°夾角時(shí)，記錄壓力值。

1.3.7 玉米葉片糖含量檢測(cè) 糖含量的測(cè)定參照路文靜等[27]的方法進(jìn)行。

1.3.8 葉綠體超微結(jié)構(gòu)觀察 制作玉米葉片超微切片，在透射電鏡下觀察。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 17. 0 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析，應(yīng)用t檢驗(yàn)法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 油菜素內(nèi)酯提高玉米抗禾谷鐮孢侵染的能力

在未接種禾谷鐮孢的生長(zhǎng)狀態(tài)下，玉米莖稈表面健康光滑(圖1-A)，剖面內(nèi)正常，無(wú)病菌侵染(圖1-B)；在未噴施BR1的自然生長(zhǎng)條件下，在玉米上接種禾谷鐮孢，15 d后調(diào)查玉米發(fā)病情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)莖稈表面有明顯的病原菌沿接種針孔侵染擴(kuò)散的痕跡(圖1-C)，剖面內(nèi)玉米髓組織黑褐色嚴(yán)重，幾乎整個(gè)節(jié)間均已被侵染(圖1-D)；但在噴施1 mg/L BR 10 d后再接種禾谷鐮孢，15 d后調(diào)查玉米發(fā)病情況，發(fā)現(xiàn)莖稈表面雖然仍有病原菌沿接種針孔侵染擴(kuò)散的痕跡(圖1-E)，但剖面內(nèi)玉米髓組織黑褐色明顯減輕，發(fā)病程度明顯減輕(圖1-F)。

圖1 BR處理對(duì)玉米抗禾谷鐮孢侵染的影響Fig.1 Effect of BR on net photosynthetic rate in maize leaf

2.2 BR處理對(duì)玉米抗倒伏能力的影響

禾谷鐮孢侵染導(dǎo)致的莖腐病是造成玉米倒伏、減產(chǎn)的主要原因。因此，檢測(cè)了玉米莖稈抗倒伏能力，在一定程度上反映BR提高玉米抗禾谷鐮孢侵染能力。本研究利用YYD-1B數(shù)顯植物莖稈強(qiáng)度檢測(cè)儀(浙江托普)對(duì)不同處理的玉米進(jìn)行莖稈抗倒伏強(qiáng)度測(cè)定，結(jié)果表明，1 mg/L BR處理后玉米莖稈抗倒伏強(qiáng)度是172.32 kPa，而未用BR處理的對(duì)照玉米莖稈抗倒伏強(qiáng)度是121.61 kPa。說(shuō)明BR處理增強(qiáng)了玉米莖稈的抗倒伏能力。

2.3 BR對(duì)禾谷鐮孢生長(zhǎng)發(fā)育的影響

分別在含0，1，2 mg/L BR的PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)禾谷鐮孢，3 d后觀察禾谷鐮孢生長(zhǎng)情況(圖2)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BR處理對(duì)禾谷鐮孢的生長(zhǎng)發(fā)育沒(méi)有明顯的影響(表1)。

圖2 BR處理3 d對(duì)禾谷鐮孢生長(zhǎng)發(fā)育的影響Fig.2 Effect of 3 days BR treatment on the growth and development of Fusarium graminearum

表1 BR對(duì)禾谷鐮孢菌株生長(zhǎng)速度的影響Tab.1 The effect of BR on the growth rate of the strain of Fusarium graminearum

注：表中數(shù)據(jù)差異均不顯著。

Note：No significant difference in data in the table.

2.4 BR處理對(duì)玉米碳水化合物代謝的影響

玉米在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，若體內(nèi)缺乏碳、糖等有機(jī)營(yíng)養(yǎng)則會(huì)造成植株細(xì)弱竄高，抵抗病原菌能力降低。本研究表明，BR處理后，玉米葉片的可溶性糖含量為3.50 mg/g，極顯著高于對(duì)照葉片的2.80 mg/g可溶性糖含量(表2)，可溶性糖含量的增加可為增強(qiáng)玉米抗病能力提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

表2 BR對(duì)玉米抗逆性相關(guān)指標(biāo)的影響Tab.2 The effect of BR on the resistance index in maize

注：表中同行內(nèi)不同小寫(xiě)和大寫(xiě)字母分別表示5%和1%差異顯著水平。

Note：Different small and capital letters in a row indicate 5% and 1% significant level respectively.

A和B. 白天14：00玉米葉綠體超微結(jié)構(gòu)(A.對(duì)照；B.BR處理15 d)；SG.淀粉粒；C 和 D.凌晨5：00玉米葉綠體超微結(jié)構(gòu)(C.對(duì)照；D.BR處理15 d)；白色箭頭.大量?jī)?nèi)含物；Bar=300 nm。

A and B. The ultrastructure of the maize chloroplast at 14:00 in light (A. Control; B. 15 days after BR treatment); SG. Starch granule; C，D. The ultrastructure of the maize chloroplast at 5:00 in the morning (C. Control; D.15 days after BR treatment); The arrow shows the bulk inclusion. Bar=300 nm.

圖3BR處理對(duì)玉米葉綠體超微結(jié)構(gòu)的影響
Fig.3EffectofBRoncellultrastructureofmaizechloroplast

對(duì)玉米葉片葉綠體超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)，白天BR處理后的葉綠體中淀粉粒積累明顯多于對(duì)照；夜晚BR處理后的葉綠體中呈現(xiàn)大量?jī)?nèi)含物，推測(cè)可能是由于淀粉轉(zhuǎn)化為大量可溶性蔗糖，然后運(yùn)出葉綠體(圖3)。

2.5 BR處理對(duì)玉米脯氨酸代謝的影響

脯氨酸是植物蛋白組分之一，是一種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，以游離狀態(tài)存在于植物體內(nèi)，脯氨酸的積累有利于植物的抗逆性。本研究發(fā)現(xiàn)，BR處理后的玉米葉片內(nèi)脯氨酸含量為9.80 μg/g，而未經(jīng)BR處理的對(duì)照葉片脯氨酸含量是8.18 μg/g，且差異達(dá)顯著水平(表2)，脯氨酸含量的增加有利于玉米快速合成抗病相關(guān)蛋白，增強(qiáng)其抗病能力。

為進(jìn)一步分析BR對(duì)脯氨酸代謝的影響，本研究對(duì)BR處理后玉米葉片中調(diào)控脯氨酸合成的基因ZmP5CS進(jìn)行實(shí)時(shí)定量分析，結(jié)果如圖4所示，接種禾谷鐮孢菌1 h和3 h后，對(duì)照和BR處理的葉片中編碼脯氨酸合成酶的基因ZmP5CS的表達(dá)量差異均極顯著，接種5 h后，ZmP5CS的表達(dá)量沒(méi)有繼續(xù)增加，說(shuō)明在接種禾谷鐮孢菌3 h內(nèi)，BR處理和對(duì)照葉片的脯氨酸的合成代謝均明顯增強(qiáng)，但在接種相同時(shí)間內(nèi)，BR處理的葉片中ZmP5CS的表達(dá)量極顯著高于對(duì)照，表明 BR處理可促進(jìn)脯氨酸的合成，從而使脯氨酸積累，增強(qiáng)植物抵抗逆境的能力。

圖中不同大寫(xiě)字母表示差異水平極顯著(P<0.01)；不同小寫(xiě)字母表示差異水平顯著(P<0.05)。In the figure, the different capital letters indicate very significant difference(P<0.01);Different lowercase indicate significant difference(P<0.05).

2.6 BR處理對(duì)玉米保護(hù)酶活性的影響

本研究分析了BR處理后玉米葉片的SOD、POD和PAL的活性，結(jié)果表明，BR處理后，玉米葉片中SOD和POD的酶活性分別為3.98，0.12 U，對(duì)照葉片的SOD和POD的酶活性分別為3.20，0.02 U，且BR處理與對(duì)照的差異分別達(dá)顯著或極顯著水平(表2)，說(shuō)明BR處理后保護(hù)酶活性快速提升，迅速清除活性氧，降低活性氧對(duì)生物大分子的破壞作用；PAL(苯丙氨酸解氨酶)是一個(gè)可把苯丙氨酸用于酚類(lèi)化合物合成的酶。本研究結(jié)果表明，BR處理后玉米葉片中PAL的活性為0.46 U，顯著高于對(duì)照葉片中0.34 U的PAL活性，說(shuō)明BR處理可提高PAL的活性，進(jìn)而增加酚類(lèi)物質(zhì)的合成，增強(qiáng)玉米抗病能力。

3 結(jié)論與討論

在我國(guó)，鐮孢莖腐病非常普遍，因病減產(chǎn)可達(dá)20%。近年來(lái)推廣高密度種植方式，田間環(huán)境利于鐮孢菌的侵染和莖腐病的發(fā)生，同時(shí)，由莖腐病引發(fā)或加劇的植株早衰、倒伏現(xiàn)象成為推廣高密度種植技術(shù)的主要障礙。目前，缺少理想的抗性品種，常用的化學(xué)或生物殺菌劑的效果并不理想。油菜素內(nèi)酯(BR)作為一種新型綠色環(huán)保植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，一般可使農(nóng)作物增產(chǎn)10%～20%，甚至高達(dá)30%，并能明顯改善品質(zhì)，提高作物抗旱、抗寒能力，緩解作物遭受病蟲(chóng)害、藥害、肥害、凍害的癥狀[17,28]。BR增強(qiáng)水稻、馬鈴薯、小麥等植物對(duì)真菌、細(xì)菌、病毒等的抗性早已有報(bào)道[29-30]，但BR的抗病機(jī)制研究較少，因?yàn)锽R提高植物抗病性機(jī)制不同于公認(rèn)的抗病途徑，BR誘導(dǎo)的抗性不需要水楊酸生物合成，也不用誘導(dǎo)(病程相關(guān)蛋白)PR相關(guān)基因的表達(dá)，因此，BR誘導(dǎo)抗性不同于水楊酸類(lèi)的系統(tǒng)獲得抗病性 (Systemic acquired resistance，SAR)，可能有其獨(dú)特的機(jī)制(BR-mediated disease resistance，BDR)[30]?；谏鲜鲈?，本研究確認(rèn)了BR在玉米抵抗禾谷鐮孢侵染中的作用，并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行了分析。

植物受到病原物侵染后，會(huì)引起一些酚類(lèi)代謝相關(guān)酶的活性增強(qiáng)，其中以苯丙氨酸解氨酶和過(guò)氧化物酶最重要。SOD和POD可以清除植物體內(nèi)活性氧自由基，使細(xì)胞生物大分子免遭膜脂過(guò)氧化引起的傷害[31]。PAL的活性與酚類(lèi)化合物的合成密切，多酚的氧化與POD有關(guān)，POD活性的增強(qiáng)可以大大增加酚氧化物的含量，酚被氧化后可鈍化病原菌的蛋白質(zhì)、酶和核酸，對(duì)病原菌產(chǎn)生毒性，提高作物抗病能力。本研究表明，BR處理可提高SOD、POD和PAL酶活性，清除活性氧的積累，提高玉米自身免疫能力，同時(shí)產(chǎn)生較多的酚類(lèi)化合物，對(duì)防止病菌擴(kuò)展及抗病起到一定的作用。本研究結(jié)果表明，BR處理可促進(jìn)玉米葉片中可溶性糖和脯氨酸的積累，為玉米生長(zhǎng)發(fā)育提供物質(zhì)基礎(chǔ)，同時(shí)還可以為抗病相關(guān)新物質(zhì)的合成提供中間產(chǎn)物，這些生理變化均在BR提高玉米的抗性過(guò)程中起著重要的作用。

油菜素內(nèi)酯對(duì)禾谷鐮孢的生長(zhǎng)發(fā)育沒(méi)有抑制作用；油菜素內(nèi)酯提高玉米抗禾谷鐮孢侵染的原因不是抑制禾谷鐮孢的生長(zhǎng)發(fā)育，而是通過(guò)提高玉米保護(hù)酶活性、可溶性糖含量、調(diào)控脯氨酸的代謝，從而提高玉米自身免疫能力。