陳 漪,胡瑞芹,冉皓宇,陳良標(biāo)

(1. 海洋生物科學(xué)國(guó)際聯(lián)合研究中心(上海海洋大學(xué), 中國(guó)科學(xué)技術(shù)部), 上海 201306;2. 水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(上海海洋大學(xué)), 上海 201306; 3. 水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心(上海海洋大學(xué))，上海 201306)

斑馬魚(yú)(Daniorerio)作為脊椎動(dòng)物中的模式生物，具有繁殖容易、發(fā)育快、體外受精、體外發(fā)育、胚胎透明等優(yōu)點(diǎn)，有利于研究胚胎發(fā)育過(guò)程。斑馬魚(yú)胚胎的早期發(fā)育是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程，涉及到了細(xì)胞分裂、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、胚層形成、背腹分化、前后軸線分化以及器官形成等多個(gè)方面[1-3]。這些生理進(jìn)程中諸多信號(hào)通路互相協(xié)調(diào)、共同作用，聯(lián)合控制著整個(gè)發(fā)育過(guò)程。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外有大量的研究均采用斑馬魚(yú)為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物展開(kāi)，并且在與生物早期胚胎相關(guān)的諸多領(lǐng)域中有重要發(fā)現(xiàn)，例如環(huán)境或化學(xué)因素對(duì)發(fā)育過(guò)程的影響、細(xì)胞活動(dòng)、物質(zhì)形成以及組織和器官的形成機(jī)制等。

斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育至4hpf即胚胎球型期(sphere)，是介于囊胚(blastula)和外包(epiboly)兩個(gè)時(shí)期之間的過(guò)渡時(shí)期。研究sphere時(shí)期的基因和蛋白質(zhì)表達(dá)的模式有助于揭示斑馬魚(yú)早期發(fā)育關(guān)鍵時(shí)期的調(diào)控機(jī)制。在斑馬魚(yú)的胚胎形成過(guò)程中，從囊胚期到外包期的過(guò)程是合子基因起始表達(dá)的關(guān)鍵時(shí)期，胚層細(xì)胞也開(kāi)始分化和協(xié)同運(yùn)作，然而其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜且機(jī)制尚不明確。有研究發(fā)現(xiàn)在斑馬魚(yú)胚胎囊胚期，分子粘連蛋白在深層細(xì)胞間形成放射狀的相互聯(lián)系[4]促使胚胎正常外包；有許多信號(hào)通路涉及到斑馬魚(yú)胚胎囊胚到外包的調(diào)控過(guò)程，諸如Wnt/PCP通路、PDGF-PI3K通路、Eph-Ephrin信號(hào)通路、Jak-Stat信號(hào)通路及MAP激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)等[5-9]。

蛋白質(zhì)是基因功能的最終執(zhí)行者，也是細(xì)胞增殖、分化、凋亡等生命活動(dòng)的直接體現(xiàn)者[10]。利用蛋白質(zhì)組學(xué)可以從蛋白質(zhì)水平了解生物個(gè)體、組織器官的發(fā)育形成過(guò)程和基因調(diào)控機(jī)制。蛋白質(zhì)組學(xué)的研究實(shí)現(xiàn)了同基因組、轉(zhuǎn)錄組分析的對(duì)接，為發(fā)育生物學(xué)各領(lǐng)域的研究提供更可靠的理論依據(jù)[11-12]。

基于高通量測(cè)序的基因組和轉(zhuǎn)錄組研究已經(jīng)廣泛的應(yīng)用于斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育過(guò)程，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組可以對(duì)各個(gè)階段的基因表達(dá)模式和表達(dá)差異動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行比較分析。然而全基因組序列和轉(zhuǎn)錄組水平的基因表達(dá)并不足以闡明參與調(diào)控斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育過(guò)程的一些生物功能和機(jī)制。在整體的功能研究中需要在基因水平和蛋白水平上相互驗(yàn)證、互為補(bǔ)充[13]。蛋白組學(xué)的研究在許多魚(yú)類的發(fā)育過(guò)程中均有報(bào)道，諸如在金魚(yú)(Carassiusauratusl)胚胎發(fā)育早期[14]、鮭魚(yú)從體節(jié)期到器官形成階段[15]、草魚(yú)(Ctenopharyngodonidellus)的肝臟器官發(fā)育[16]及斑馬魚(yú)卵巢發(fā)育階段[17-18]等。

常規(guī)的2D-GE和 MudPIT的蛋白組鑒定方法能夠檢測(cè)到的蛋白質(zhì)數(shù)量十分有限。相對(duì)和絕對(duì)定量的等量異位標(biāo)簽iTRAQ (isobaric tags for relative and absolute quantitation) 是由美國(guó)ABI應(yīng)用生物系統(tǒng)公司研發(fā)的一種多肽體外標(biāo)記技術(shù)[19]。 iTRAQ標(biāo)記聯(lián)合質(zhì)譜分析具有分離能力強(qiáng)、分析范圍大、高靈敏度及定性分析結(jié)果較可靠等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已成為差異蛋白質(zhì)組學(xué)定量研究的主要工具之一[20]。iTRAQ標(biāo)記與LC-MS/MS串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)研究的各個(gè)方面。在斑馬魚(yú)中，iTRAQ被廣泛用于鰓組織[21]、肝組織[22]、中樞神經(jīng)系統(tǒng)[23]以及胚胎[24]的蛋白質(zhì)組學(xué)研究中。

本研究以高通量和高靈敏度的iTRAQ蛋白質(zhì)組定性定量技術(shù)為基礎(chǔ)，結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC -MS /MS)，檢測(cè)斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育sphere時(shí)期蛋白質(zhì)表達(dá)情況，探索新的蛋白質(zhì)，并進(jìn)一步分析這些蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能，從而獲得不同蛋白在該時(shí)期的表達(dá)情況及其參與的生物學(xué)過(guò)程，以期為進(jìn)一步研究斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育過(guò)程及其調(diào)控機(jī)制提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

斑馬魚(yú)及胚胎收集：AB品系的野生型斑馬魚(yú)購(gòu)于北京中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所，在本實(shí)驗(yàn)室循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)中養(yǎng)殖傳代。孵化后斑馬魚(yú)在3 L魚(yú)缸中養(yǎng)殖至性成熟，以適宜水環(huán)境飼養(yǎng)，水溫為(28.5±0.5) ℃， pH值7±0.5，電導(dǎo)率450～550μS；通過(guò)自動(dòng)光照系統(tǒng)控制光照周期(明14 h，暗10 h)。每天2次(9∶00, 18∶00)按時(shí)投喂初孵豐年蟲(chóng)。繁殖時(shí)將雌雄斑馬魚(yú)(各1條)置于孵化缸內(nèi)以隔板隔開(kāi)，次日將隔板抽離，使雌雄魚(yú)追尾產(chǎn)卵，約10 min后將親魚(yú)轉(zhuǎn)移至另一盛有干凈循環(huán)水的缸中并標(biāo)記產(chǎn)卵日期。收集孵化缸底斑馬魚(yú)胚胎，置于培養(yǎng)皿中，清洗并加入E3培養(yǎng)基，斑馬魚(yú)胚胎在恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)育，溫度為(28.5±0.5) ℃。發(fā)育至4 hpf的斑馬魚(yú)胚胎在PBS緩沖液中快速剝?nèi)ヂ褮ぃヂ褮さ陌唏R魚(yú)胚胎取100枚收集到干凈的1.5 mL EP管中，吸去多余的PBS，放入液氮中速凍5 min，-80 ℃保存待用。共取3組相同時(shí)期、相同處理?xiàng)l件、相同數(shù)目不同親本斑馬魚(yú)所產(chǎn)的胚胎樣品。

1.2 主要試劑與儀器

iTRAQ Reagent-8Plex Multiplex Kit購(gòu)自AB Sciex公司；液相Easy nLC/ Ultimate 3000、色譜柱(C18 1.9 mm 150 μm×120 mm)、色譜預(yù)柱(C18 3 mm 100 μm×20 mm) 均購(gòu)自于Thermo Scientific公司；HPLC分級(jí)液相1260 infinity Ⅱ購(gòu)自Agilent公司；HPLC分級(jí)色譜柱xBridge peptide BEH 130 C18 column 購(gòu)自Waters公司；Q-Exactive HF質(zhì)譜儀購(gòu)自Thermo Scientific公司。

1.3 斑馬魚(yú)魚(yú)卵蛋白質(zhì)提取和iTRAQ標(biāo)記

1.3.1 斑馬魚(yú)卵蛋白質(zhì)提取、定量及電泳

每組冷凍保存的樣品溶解后加入裂解液(含8 M尿素)、50 mM 的NH4HCO3以及蛋白酶抑制劑。裂解樣品速度1 000 g以上，4 ℃離心30 min，取上清液。提取的總蛋白進(jìn)行去高豐度處理(高豐度卵黃蛋白)。根據(jù) Bradford 法測(cè)蛋白濃度，確定 SDS-PAGE 和 iTRAQ 分析所需要的蛋白量。各取25 μL蛋白質(zhì)樣品5∶1(v/v)加入5×體積上樣緩沖液，沸水浴5 min，轉(zhuǎn)速14 000 r·min-1離心10 min后取上清液，進(jìn)行10% SDS-PAGE電泳。電泳條件：恒流14 mA，時(shí)間90 min。電泳后進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色檢測(cè)蛋白質(zhì)量。

1.3.2 蛋白Trypsin酶切和iTRAQ標(biāo)記

蛋白質(zhì)定量后每個(gè)樣品取200 μg置于離心管中，加入5 μL的1 M DTT(二硫蘇糖醇)，37 ℃孵育1 h后，加入20 μL 1 M的IAA (吲哚乙酸)，混勻后，室溫下避光反應(yīng)1 h。吸取所有樣品加入超濾管中，離心后棄收集液；加入100 μL UA(8M urea，100 mM Tris-HCl，pH8.0)至超濾管中，離心后棄收集液，重復(fù)2次；加入0.5 M TEAB 100 μL，離心后棄收集液，重復(fù)3次；更新收集管，在超濾管中加入胰蛋白酶，按照蛋白和酶50∶1(w/w)的比例加入Trypsin，37 ℃酶解12～16 h。取100 μg 酶解片段脫鹽處理，按照AB公司試劑盒iTRAQ Reagent-8Plex說(shuō)明書(shū)進(jìn)行標(biāo)記。3組蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行iTRAQ標(biāo)記標(biāo)簽分子量分別為113(A-4h-1)、114(A-4h-2)、117(A-4h-3)。標(biāo)記之后取少量樣本混合，進(jìn)行LC-MS/MS質(zhì)譜檢測(cè)，查看iTRAQ標(biāo)記效率。

1.4 高pH條件下HPLC分離肽段混合物及質(zhì)譜分析

1.4.1 高pH條件下C18色譜柱的HPLC分級(jí)

將標(biāo)記抽干后的肽段樣品用100 μL液相A流動(dòng)相復(fù)溶，渦旋振蕩，轉(zhuǎn)速14 000 r·min-1離心20 min，吸取上清液進(jìn)行色譜上樣；準(zhǔn)備60個(gè)空白1.5 mL離心管，依次標(biāo)記為1～60，用于收集分離得到的組份1～60。在高pH條件下HPLC儀中進(jìn)行反相分離。使用色譜柱(C18 1.9 mm 150 μm×120 mm)，流速為0.7 mL·min-1。A相流動(dòng)相為2%乙腈(ACN)、98% Milipore水，pH10；B相流動(dòng)相為98% ACN和2% Milipore水，pH10。B相梯度如下：0～3 min升至 5%，保持2min，5～45 min升至35%，45～53 min升至90%，保持7 min。從5 min開(kāi)始，依次收集每1.5 min洗脫物到1～60號(hào)離心管中，真空冷凍離心干燥。

1.4.2 質(zhì)譜分析

將干燥后的樣品用5 μL 0.5%的甲酸(FA)重溶，并將收集到的60個(gè)組分合并成多個(gè)組分，將合并后的組分轉(zhuǎn)速14 000 r·min-1離心10 min，吸取上清上樣10 μL，進(jìn)行高效液相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)(HPLC-MS/MS)分級(jí)分析。采用毛細(xì)管高效液相色譜，每份樣品采用納升流速HPLC液相系統(tǒng)進(jìn)行分離。色譜柱以95%的A液平衡。樣品由自動(dòng)進(jìn)樣器上樣到質(zhì)譜預(yù)柱(C18 3 mm 100 μm×20 mm)，再經(jīng)分析柱分離，流速及相關(guān)液相梯度如下：流速為600 nL·min-1，A相流動(dòng)相為0.1% FA、99.9% Milipore水；B相流動(dòng)相為0.1% FA、99.9% ACN。B相梯度如下：初始5%，0～16 min升至10%，16～51 min升至22%，51～71min升至30%，71～72 min升至95%，72～78 min維持95%。每份樣品經(jīng)毛細(xì)管高效液相色譜分離后用質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析。質(zhì)譜全掃描質(zhì)量范圍300～1400 m·z-1，分辨率150 000，選取一級(jí)信號(hào)強(qiáng)度最高的20個(gè)離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，二級(jí)質(zhì)譜全掃描質(zhì)量范圍200～2 000 m·z-1，動(dòng)態(tài)排除設(shè)置為12 s。

1.4.3 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索

使用Proteome Discovery搜庫(kù)軟件(Thermo Fisher) ，Mascot (Version 2.2)搜索引擎對(duì)Uniprot database斑馬魚(yú)數(shù)據(jù)庫(kù)(uniprot-danio+rerio_170221.fasta)進(jìn)行搜庫(kù)。搜庫(kù)參數(shù)如表1所示。結(jié)果過(guò)濾參數(shù)為：Peptide FDR≤0.01，Peptide score>10。

表1 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索參數(shù)Tab.1 Protein database retrieval parameters

1.5 生物信息學(xué)分析

對(duì)鑒定出的蛋白進(jìn)行生物過(guò)程及分子功能分析。通過(guò)Gene Ontology數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.geneontology.org)對(duì)鑒定蛋白作GO功能注釋分析；通過(guò)KEGG公共數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.kegg.jp/kegg/pathway.html)對(duì)鑒定蛋白作KEGG功能注釋分析，進(jìn)行Pathway代謝通路注釋；將鑒定到的蛋白和KOG數(shù)據(jù)庫(kù)(cluster of orthologous groups of proteins，蛋白相鄰類的聚簇)進(jìn)行比對(duì)，對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行直系同源分類并預(yù)測(cè)這些蛋白可能的功能，然后做功能分類統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育4hpf時(shí)期形態(tài)

斑馬魚(yú)早期胚胎發(fā)育根據(jù)形態(tài)可以劃分成7大時(shí)期——合子期(zygote)、卵裂期(cleavage)、囊胚期(blastula)、原腸胚期(gastrula)、體節(jié)期(segmentation)、咽囊期(pharyngula)及孵化期(hatching period)，隨后進(jìn)入仔稚魚(yú)階段。斑馬魚(yú)的早期胚胎發(fā)育在4hpf時(shí)期進(jìn)入決定胚胎發(fā)育方向的關(guān)鍵時(shí)期。胚胎從受精至發(fā)育4 h，胚胎處于囊胚后期，動(dòng)物極囊胚細(xì)胞進(jìn)行不同步分裂，由于細(xì)胞的持續(xù)分裂與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，胚盤(pán)由原先的橢球形變?yōu)榍蛐?，?xì)胞向外擴(kuò)展(圖1-A)，胚盤(pán)變平與卵黃形成水平邊界(圖1-B)，稱之為球型(sphere)階段。從圖1-C中紅色箭頭所示處可以明顯看到箭頭上方較小的囊胚細(xì)胞和下方較大的卵黃細(xì)胞。經(jīng)歷sphere階段之后，胚胎卵黃細(xì)胞逐漸向動(dòng)物極突起，胚層開(kāi)始不均一增厚，胚胎進(jìn)入外包期(epiboly)。

2.2 蛋白提取SDS-PAGE電泳分析

斑馬魚(yú)胚胎4hpf時(shí)期提取的各組蛋白樣品經(jīng) Bradford 法蛋白定量及SDS-PAGE電泳。對(duì)電泳結(jié)果分析表明，3個(gè)平行重復(fù)樣本中總蛋白在10～220 kDa分子量范圍內(nèi)得到有效分離，3組樣品蛋白特異條帶明顯，相應(yīng)的蛋白條帶清晰、完整，蛋白沒(méi)有發(fā)生明顯降解。從電泳譜帶上看，各組斑馬魚(yú)胚胎總蛋白中的高豐度脂質(zhì)得到有效的去除，樣品之間平行度較好，整體蛋白電泳譜帶具有相似的帶型，蛋白條帶分布均勻、分辨率高且呈現(xiàn)多樣性，含有的蛋白亞基種類和數(shù)量相似(圖2)。初步表明蛋白的提取效果較為理想，蛋白總量和純度滿足進(jìn)行下一步蛋白標(biāo)記，液相色譜分級(jí)分離實(shí)驗(yàn)。

2.3 質(zhì)譜鑒定和iTRAQ定量分析

經(jīng)質(zhì)譜分析并比對(duì)uniprot-danio+rerio_170221.fasta 數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)果得出：iTRAQ標(biāo)記效率為98.00%，鑒定到的總蛋白為1 178個(gè)，鑒定共計(jì)獲得唯一肽段7 351個(gè)(圖3)，其中2段以上不同肽段覆蓋的蛋白704種，占全部鑒定蛋白的59.76%；5段以上不同肽段覆蓋蛋白398種，占全部鑒定蛋白的33.78%。通過(guò)iTRAQ標(biāo)記，LS-MS/MS技術(shù)有效的分離和鑒定出了斑馬魚(yú)4hpf發(fā)育階段胚胎中蛋白質(zhì)的表達(dá)情況。3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)之間的蛋白定量比值平均值都在1附近，表明3組蛋白樣品之間重復(fù)性較好，檢測(cè)出的蛋白質(zhì)可信度較高。

對(duì)鑒定獲得的1 178個(gè)蛋白質(zhì)的分子量和等電點(diǎn)兩種基本理化性質(zhì)的分布進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示，所有鑒定到的蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量分布在6.0～545.4 kDa之間，等電點(diǎn)范圍為3.61～12.12。其中蛋白質(zhì)等電點(diǎn)主要分布在5.0～8.9之間，占鑒定到蛋白總數(shù)的77.92%，92%的蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量在10～110 kDa之間(圖4,圖5)。

圖1 斑馬魚(yú)4hpf時(shí)期胚胎形態(tài)Fig.1 Features of Danio rerio embryo in 4hpf stage注：A為胚胎正面觀，B為側(cè)面觀；A、B比例尺為200 μm；C比例尺為100 μm；B、C中紅色箭頭所示為與胚胎囊胚細(xì)胞與卵黃細(xì)胞交界處Notes: A shows surface view of embryo, B shows lateral view of embryo; scale bar of A and B is 200 μm, scale bar of C is 100 μm; the red arrows in B and C point out the cell boundary

圖2 斑馬魚(yú)4hpf胚胎蛋白SDS-PAGE圖譜Fig.2 SDS-PAGE diagram ofDanio rerio 4hpf embryos protein注：M：蛋白標(biāo)準(zhǔn)marker；4h-1、4h-2、4h-3：分別為3組不同批次的4hpf斑馬魚(yú)胚胎蛋白Notes: M:protein marker; 4h-1,4h-2,4h-3 are 3 different groups of Danio rerio 4hpf embryos, respectively

圖3 鑒定肽段數(shù)量分布圖Fig.3 Peptide count distribution

圖4 鑒定蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量分布圖Fig.4 Relative molecular weight distribution of protein

圖5 鑒定蛋白質(zhì)等電點(diǎn)分布圖Fig.5 Isoelectric point distribution of protein

本研究對(duì)檢測(cè)到的所有蛋白進(jìn)行了相對(duì)平均表達(dá)量的測(cè)定。定量結(jié)果發(fā)現(xiàn)，金屬結(jié)合蛋白、轉(zhuǎn)移酶類、水解酶類的表達(dá)量較低；而卵黃蛋白原、熱休克蛋白、肌動(dòng)蛋白和微管蛋白則具有明顯的高表達(dá)(表2)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，iTRAQ標(biāo)記方法對(duì)胚胎中低豐度蛋白也有良好的檢測(cè)效果。經(jīng)分析，胚胎中高表達(dá)的蛋白質(zhì)對(duì)于維持胚胎的正常營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、能量代謝十分重要。另外，在鑒定出的蛋白中有426個(gè)未知蛋白，在數(shù)據(jù)庫(kù)中沒(méi)有相應(yīng)的注釋，其中20個(gè)蛋白具有顯著的高表達(dá)，初步推測(cè)這些未知蛋白在胚胎發(fā)育4hpf時(shí)期具有重要的功能，但其具體功能有待進(jìn)一步的研究。

2.4 蛋白功能的注釋分析

研究進(jìn)一步通過(guò)生物信息分析的方法對(duì)鑒定出的蛋白進(jìn)行功能注釋分析。對(duì)檢測(cè)到的蛋白分別進(jìn)行了GO 注釋(圖6)、COG 注釋(圖7)。這些蛋白分別注釋到了3類總共48個(gè)不同的GO term上。共有769個(gè)蛋白與生物過(guò)程(biological process)的功能相關(guān)，分析中可以看出在斑馬魚(yú)4hpf發(fā)育階段表達(dá)量較高的蛋白參與較多的生物過(guò)程分別是細(xì)胞代謝、刺激應(yīng)答、單一生物體過(guò)程、生物調(diào)節(jié)、細(xì)胞進(jìn)程以及發(fā)育過(guò)程(圖6-A)。經(jīng)分析有673個(gè)蛋白具有細(xì)胞組成(cellar component)功能，在該階段胚胎中，參與細(xì)胞組成的主要蛋白類型為大分子復(fù)合物、細(xì)胞器組成蛋白、細(xì)胞成分蛋白以及細(xì)胞膜組成蛋白(圖6-B)。912個(gè)蛋白質(zhì)注釋到分子功能(molecular function)上，蛋白參與數(shù)目較多的分子功能分別為催化活性、結(jié)合活性、分子結(jié)構(gòu)形成活性和分子轉(zhuǎn)運(yùn)活性(圖6-C)。 COG(cluster of orthologous groups of proteins， 蛋白相鄰類的聚簇)是對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行直系同源分類的數(shù)據(jù)庫(kù)。在COG注釋分析中發(fā)現(xiàn)，其中參與細(xì)胞信息存儲(chǔ)處理的蛋白有119種，其中最顯著的是蛋白翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)與生物合成功能；參與細(xì)胞代謝過(guò)程的有107種，主要與碳水和脂質(zhì)代謝相關(guān)；參與細(xì)胞進(jìn)程與信號(hào)傳導(dǎo)的有183種，大多數(shù)為翻譯后修飾與分子伴侶相關(guān)蛋白。

表2 斑馬魚(yú)4hpf時(shí)期胚胎高表達(dá)蛋白質(zhì)Tab.2 High expression proteins in 4hpf stage of Danio rerio embryo

對(duì)鑒定出蛋白進(jìn)行KEGG Pathway代謝通路注釋，發(fā)現(xiàn)這些蛋白所涉及到的Pathway多達(dá)129條，其中富集蛋白數(shù)目在10個(gè)以上的有30條(圖8)。參與蛋白最多的是核糖體相關(guān)通路，其次還有碳代謝、剪接體相關(guān)通路、細(xì)胞內(nèi)吞作用、氧化磷酸化、RNA轉(zhuǎn)運(yùn)、氨基酸的生物合成與降解、細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)相關(guān)通路等。

3 討論

在斑馬魚(yú)早期胚胎發(fā)育過(guò)程中蛋白質(zhì)的含量和蛋白質(zhì)水平的調(diào)控對(duì)于胚胎的正常發(fā)育進(jìn)程十分關(guān)鍵。蛋白質(zhì)組能夠直觀的反映特定時(shí)期內(nèi)的胚胎中基因和其它相關(guān)調(diào)控因子在決定胚胎表型和細(xì)胞的分化命運(yùn)時(shí)發(fā)揮功能的情況。

斑馬魚(yú)的胚胎發(fā)育的囊胚階段(2.25～4.66 hpf)[25]，胚胎在形態(tài)上和分子水平上都發(fā)生復(fù)雜的變化。在基因?qū)用?，囊胚中期，胚胎?jīng)歷母型-合子型轉(zhuǎn)換(MZT)過(guò)程，大量合子型基因表達(dá)并伴隨著母源mRNA降解[26]；在細(xì)胞層面，囊胚晚期胚胎細(xì)胞進(jìn)行著快于任何發(fā)育階段的細(xì)胞重排和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，繼而動(dòng)物極下包，進(jìn)入原腸胚階段。斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育的4 hpf時(shí)期(sphere)，是介于囊胚和外包兩個(gè)時(shí)期之間的過(guò)渡時(shí)期，胚胎剛剛由母源型調(diào)控轉(zhuǎn)為合子型調(diào)控，開(kāi)始了大量的基因轉(zhuǎn)錄活動(dòng)，該時(shí)期積累的蛋白質(zhì)以及它們的調(diào)控作用影響了胚胎發(fā)育后續(xù)的外包(epiboly)階段。

本研究采用iTRAQ標(biāo)記與LC-MS/MS串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，在斑馬魚(yú)早期胚胎發(fā)育4 hpf時(shí)期的胚胎中共鑒定到1 178種蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)廣泛的參與到細(xì)胞中的物質(zhì)合成與代謝、細(xì)胞信號(hào)傳遞、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和細(xì)胞骨架、細(xì)胞增殖及其調(diào)控、細(xì)胞分化與轉(zhuǎn)錄調(diào)控等各項(xiàng)生命活動(dòng)過(guò)程。盡管目前對(duì)斑馬魚(yú)早期各個(gè)階段的轉(zhuǎn)錄組均有比較詳盡的分析和研究，但是關(guān)于斑馬魚(yú)早期胚胎發(fā)育的蛋白組學(xué)研究仍然較少且研究的發(fā)育時(shí)期并不完全。TAY等[27]對(duì)斑馬魚(yú)早期發(fā)育6～72 hpf中的10個(gè)不同時(shí)期進(jìn)行蛋白質(zhì)組研究，通過(guò)雙向電泳進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)大量的蛋白質(zhì)表達(dá)量隨著發(fā)育時(shí)長(zhǎng)變長(zhǎng)而增加，同時(shí)對(duì)這些蛋白進(jìn)行定性并鑒定到了108個(gè)已知蛋白。斑馬魚(yú)單胚胎的蛋白質(zhì)組研究中，在斑馬魚(yú)3hpf去卵黃和未去卵黃胚胎中分別鑒定到499種和260種蛋白，在5hpf未去卵黃胚胎中鑒定到212種蛋白[28]。斑馬魚(yú)早期發(fā)育4hpf的胚胎蛋白組目前還沒(méi)有相關(guān)研究報(bào)道。在本研究中，利用高靈敏的iTRAQ標(biāo)記結(jié)合質(zhì)譜分析，在4hpf時(shí)期斑馬魚(yú)胚胎中鑒定到了更大數(shù)量的蛋白質(zhì)，包括已有報(bào)道的卵黃蛋白原(vitellogenin)；熱休克蛋白heat shock protein 5，heat shock protein HSP 90-beta，heat shock cognate 71 kDa protein等；分子伴侶蛋白chaperonin containing TCP1 subunit 2 (Beta)，chaperonin containing TCP1, subunit 7 (Eta)等；細(xì)胞骨架蛋白actinin alpha 4，tubulin alpha chain等翻譯功能蛋白ribosomal protein，translation initiation factor 4A等[17,22-23]，以及之前的蛋白組學(xué)研究中未能鑒定出的一些低表達(dá)的蛋白質(zhì)如Ndufa9、RhoA-C、Pgam5、Deltex1等。在本研究中對(duì)斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育4hpf時(shí)期的蛋白質(zhì)組進(jìn)行了大范圍的定性和定量檢測(cè)，得到了更大數(shù)據(jù)量且更準(zhǔn)確的斑馬魚(yú)胚胎蛋白組信息。進(jìn)一步研究這一關(guān)鍵時(shí)期中這些蛋白的功能將有助于更深入的了解斑馬魚(yú)早期胚胎發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)制起到重要的作用。檢測(cè)結(jié)果分析還發(fā)現(xiàn)有8個(gè)預(yù)測(cè)的新結(jié)構(gòu)蛋白，類似SNRPD2 結(jié)構(gòu)蛋白、類似ENDOD1結(jié)構(gòu)蛋白、含有SNF2家族 N端和解旋酶(helicase)保守C端結(jié)構(gòu)域蛋白、透明帶蛋白樣結(jié)構(gòu)域(zona pellucida-like)蛋白。除此之外還有426個(gè)，占檢測(cè)蛋白總數(shù)36.16%的蛋白被注釋為未知蛋白，這些蛋白可能在斑馬魚(yú)早期發(fā)育過(guò)程中起到重要作用但是具體功能仍有待研究。

圖6 斑馬魚(yú)4hpf時(shí)期表達(dá)蛋白GO注釋分析Fig.6 GO annotation and analysis of protein in 4hpf embryo注：a：生物過(guò)程相關(guān)蛋白GO注釋；b：細(xì)胞組成相關(guān)蛋白質(zhì)GO注釋；c：分子功能相關(guān)蛋白質(zhì)GO注釋Notes: a: GO annotation of biological process; b: GO annotation of cellar component; c: GO annotation of molecular function

圖7 斑馬魚(yú)4 hpf時(shí)期表達(dá)蛋白COG注釋Fig.7 COG annotation and analysis of protein at 4hpf stage of embryo

圖8 斑馬魚(yú)4hpf時(shí)期表達(dá)蛋白KEGG通路分析Fig.8 KEGG pathway analysis of protein in 4hpf embryo

在本研究中，經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)卵黃蛋白原 (vitellogenin, Vtgs)是斑馬魚(yú)4hpf時(shí)期胚胎中表達(dá)量最高的蛋白，同時(shí)卵黃蛋白也是斑馬魚(yú)從卵子到胚胎發(fā)育中持續(xù)表達(dá)最豐富的蛋白。目前已知在斑馬魚(yú)基因組上有7種Vtgs基因，分別為Vtg1～Vtg7，位于基因組的不同的位置上[29]。在斑馬魚(yú)中，Vtg大多在肝臟中合成，而在卵巢中也有少量Vtg mRNA的表達(dá)，在斑馬魚(yú)卵母細(xì)胞成熟的過(guò)程中，卵黃蛋白原Vtgs最早開(kāi)始在Ⅱ期表達(dá)并迅速在卵子中累積，卵黃蛋白持續(xù)表達(dá)，直到卵母細(xì)胞成熟[29]。在關(guān)于斑馬魚(yú)卵母細(xì)胞成熟過(guò)程的蛋白質(zhì)組學(xué)動(dòng)態(tài)研究中，卵黃蛋白Vtgs在斑馬魚(yú)早期卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中高表達(dá)，研究鑒定到包括Vtg1、Vtg3、Vtg4和Vtg7在卵母細(xì)胞成熟的各個(gè)階段表達(dá)呈現(xiàn)大幅增加趨勢(shì)，其中Vtg3在卵母細(xì)胞最終成熟階段上升了5倍[17]。在本研究中發(fā)現(xiàn)在斑馬魚(yú)4hpf的胚胎中，卵黃蛋白原Vtg1、Vtg2、Vtg3、Vtg7的表達(dá)量是檢測(cè)到的蛋白中表達(dá)量最高的4種蛋白，這個(gè)結(jié)果與先前的斑馬魚(yú)卵母細(xì)胞蛋白組學(xué)研究結(jié)果一致，故而認(rèn)為在斑馬魚(yú)的早期胚胎發(fā)育過(guò)程中，卵黃蛋白由母源卵子提供，在胚胎的合子發(fā)育過(guò)程中起到了重要的作用，為早期胚胎的發(fā)育提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。

通過(guò)對(duì)鑒定到的蛋白進(jìn)行GO注釋和KEGG通路分析，發(fā)現(xiàn)斑馬魚(yú)早期胚胎發(fā)育4 hpf時(shí)期表達(dá)的蛋白廣泛參與了許多重要的生物過(guò)程。包括對(duì)胚胎發(fā)育至關(guān)重要的信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)通路，如Wnt信號(hào)通路、Hedgehog信號(hào)通路和TGF-β信號(hào)通路；細(xì)胞增殖分化及細(xì)胞凋亡相關(guān)的信號(hào)通路，如：P53信號(hào)通路、Notch信號(hào)通路、NOD-like receptor信號(hào)通路等；以及涉及細(xì)胞間相互作用和信號(hào)傳遞相關(guān)的通路，如：MAPK信號(hào)通路、緊密連接、黏著斑連接等。

斑馬魚(yú)早期胚胎發(fā)育的囊胚過(guò)渡和外包過(guò)程中，細(xì)胞骨架和細(xì)胞間的粘連發(fā)揮了重要作用，破壞細(xì)胞骨架和細(xì)胞粘連[30]，阻斷MAPK信號(hào)通路[31]，均導(dǎo)致胚胎在外包前發(fā)育異常和阻滯。

KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)4hpf時(shí)期表達(dá)大量的核糖體組成以及翻譯相關(guān)蛋白質(zhì)，說(shuō)明了核糖體功能和翻譯過(guò)程在該時(shí)期的重要性。核糖體的生物合成過(guò)程在細(xì)胞中占據(jù)實(shí)質(zhì)性的細(xì)胞資源，因此它也緊密協(xié)調(diào)著細(xì)胞中的營(yíng)養(yǎng)效率[32]。在斑馬魚(yú)的早期胚胎卵裂增殖階段，胚胎細(xì)胞快速分裂需要大量能量供應(yīng)新的蛋白合成并且積累物質(zhì)為下一次分裂做準(zhǔn)備，尤其在囊胚時(shí)期，細(xì)胞開(kāi)始運(yùn)動(dòng)、分化并形成胚層，胚胎細(xì)胞的正常生物合成與細(xì)胞間的信息傳遞是保證胚胎正常發(fā)育和外包的重要條件。

綜上所述，通過(guò)iTRAQ標(biāo)記聯(lián)合LC-MS/MS的方法可以對(duì)4hpf時(shí)期的斑馬魚(yú)胚胎中的蛋白質(zhì)組進(jìn)行有效的分離和鑒定，該技術(shù)為研究斑馬魚(yú)的早期胚胎發(fā)育過(guò)程中蛋白質(zhì)組學(xué)提供了高效、可行的研究方法，也為進(jìn)一步研究斑馬魚(yú)的發(fā)育過(guò)程的調(diào)控機(jī)制提供了新的研究方向。本研究利用iTRAQ標(biāo)記建立了斑馬魚(yú)早期發(fā)育關(guān)鍵階段sphere時(shí)期的蛋白質(zhì)組表達(dá)圖譜，為后續(xù)研究斑馬魚(yú)早期胚胎在發(fā)育過(guò)程中的蛋白組學(xué)研究提供參考和奠定基礎(chǔ)。在后期的研究工作中需進(jìn)一步對(duì)4hpf時(shí)期前后的蛋白組表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)比較分析各個(gè)時(shí)期的斑馬魚(yú)胚胎中蛋白質(zhì)組的差異變化找出在斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育特定時(shí)期發(fā)揮關(guān)鍵功能的蛋白，這對(duì)研究斑馬魚(yú)早期胚胎發(fā)育的調(diào)控過(guò)程具有重要意義。

4 小結(jié)

本研究通過(guò)iTRAQ蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析技術(shù)對(duì)4hpf時(shí)期的斑馬魚(yú)胚胎中的蛋白質(zhì)組進(jìn)行有效的分離和鑒定，檢測(cè)了斑馬魚(yú)早期胚胎發(fā)育過(guò)程中囊胚sphere時(shí)期的蛋白質(zhì)表達(dá)情況，對(duì)該時(shí)期表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行定性和定量的鑒定，并分析該時(shí)期表達(dá)的蛋白質(zhì)的相應(yīng)功能和參與調(diào)控的生物過(guò)程。檢測(cè)結(jié)果共鑒定到的總蛋白數(shù)為1 178個(gè)，利用生物信息學(xué)進(jìn)行功能分析，發(fā)現(xiàn)這些蛋白廣泛參與了細(xì)胞信號(hào)傳遞、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和細(xì)胞骨架構(gòu)建、細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、物質(zhì)合成與代謝等各項(xiàng)重要的生命活動(dòng)過(guò)程。