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        基于形態(tài)與DNA條形碼的中國(guó)鲾科魚類分類研究

        2019-03-08 02:49:46唐楚林王業(yè)磷
        海洋漁業(yè) 2019年1期
        關(guān)鍵詞:細(xì)紋條形碼黃斑

        周 琪,章 群,唐楚林,徐 示,王業(yè)磷

        (暨南大學(xué)生態(tài)系,廣州 510632)

        鲾科(Leiognathidae)隸屬于鱸形目(Perciformes),廣泛分布于西太平洋及印度洋海域,中國(guó)主要分布于南海及臺(tái)灣海峽。鲾科魚類為群居性小型魚類,一般棲息于岸邊泥沙地、河口或內(nèi)灣,在沿岸軟底質(zhì)生態(tài)系統(tǒng)中占有重要地位,并具有一定經(jīng)濟(jì)價(jià)值和藥用價(jià)值[1-2]。鲾科魚類鱗片細(xì)小易脫落,體內(nèi)有可與發(fā)光細(xì)菌相互作用的發(fā)光器官和組織。目前國(guó)際上對(duì)鲾科的分類標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一 ,如ITIS(Integrated Taxonomic Information System)和《南海魚類檢索》[3]將鲾科分為3個(gè)屬:小牙鲾屬(Gazza)、鲾屬(Leiognathus)、仰口鲾屬(Secutor);CHAKRABARTY等[4]依據(jù)外部形態(tài)、體長(zhǎng)和體高的比例、發(fā)光器官和組織的特征等,將鲾科分為6個(gè)屬:鲾屬、金鲾屬(Aurigequula)、項(xiàng)鲾屬(Nechequula)、馬鲾屬(Equulites)、布氏鲾屬(Eubleekeria)、光胸鲾屬(Photopectoralis);SPARKS等[5]依據(jù)發(fā)光器官內(nèi)在和外在是否存在性二態(tài),認(rèn)為鲾科由不存在性二態(tài)的鲾屬和金鲾屬以及存在性二態(tài)的Gazzinae亞科中8個(gè)屬組成;Fishbase (http://www. fishbase. org/)記錄全球鲾科至少有8屬48種,其中中國(guó)8屬19種;陳大剛等[6]記錄全球鲾科有3屬30種,中國(guó)有3屬22種。鲾科魚類無(wú)論是外部形態(tài)還是內(nèi)部的發(fā)光器官和組織等特征具有極大的種間相似性[7],通過(guò)傳統(tǒng)形態(tài)鑒定存在較大困難。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于鲾科魚類的研究報(bào)道多為生態(tài)資源調(diào)查[8]、發(fā)光器官和組織的性二態(tài)及其發(fā)光機(jī)制的研究[9]等。在分類方面,YU[10]對(duì)臺(tái)灣海域的鲾科魚類進(jìn)行了分子上和形態(tài)上的比較分析。ABRAHAM等[11]根據(jù)詳細(xì)的形態(tài)數(shù)據(jù)研究了印度西海岸16種鲾科魚類的種間關(guān)系。但現(xiàn)有的國(guó)內(nèi)外資料不足以闡明中國(guó)沿海鲾科魚類的分類現(xiàn)狀。

        2003年HEBERT等[12-13]提出“DNA條形碼”的概念,即通過(guò)一段易于擴(kuò)增測(cè)序的標(biāo)準(zhǔn)基因序列進(jìn)行物種鑒定;對(duì)動(dòng)物界中11門13320個(gè)物種的線粒體細(xì)胞色素氧化酶Ⅰ亞基(COI)序列分析發(fā)現(xiàn),除腔腸動(dòng)物門(Cnidaria)外,多數(shù)物種種內(nèi)遺傳距離≤ 2%,種間遺傳距離遠(yuǎn)大于(一般≥10×)種內(nèi)遺傳距離,并可對(duì)98%以上的物種進(jìn)行分類。2005年WARD等[14]對(duì)澳大利亞等地海域207種魚類的研究,驗(yàn)證了COI基因序列作為海洋魚類DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)基因序列的可行性。同年國(guó)際社會(huì)開始實(shí)施魚類生命條形碼計(jì)劃,采用經(jīng)權(quán)威分類鑒定標(biāo)本的魚類線粒體COI基因序列,以電子數(shù)據(jù)庫(kù)形式,構(gòu)建含有DNA條形碼、圖像和地理坐標(biāo)的全球魚類參考標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)。雖然DNA條形碼技術(shù)有助于物種鑒定,而且對(duì)物種間群落關(guān)系多樣性(如食物網(wǎng)結(jié)構(gòu)復(fù)雜性)的研究有重要作用;但由于所使用的線粒體標(biāo)記為母系遺傳,在區(qū)分雜交種、近期分化物種時(shí)仍存在諸多問(wèn)題[15],因而準(zhǔn)確的物種分類需要DNA條形碼和形態(tài)分類研究的相互參照及驗(yàn)證[16-17]。YING等[18]利用GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)和BOLD (http://www. barcodinglife.org)下載的232條鲾科魚類6屬24種COI序列進(jìn)行了DNA條形碼分析,但并無(wú)中國(guó)黃斑鲾(L.bindus)、短吻鲾(L.brevirostris)、頸斑鲾(L.nuchalis)、短棘鲾(L.equulus)、堅(jiān)鲾(L.stercorarius)序列分析,也沒(méi)有進(jìn)行形態(tài)分析等;JU[19]利用COI序列和形態(tài)特征在中國(guó)北部灣發(fā)現(xiàn)新紀(jì)錄種Deveximentummegalolepis。

        本研究對(duì)本實(shí)驗(yàn)室在中國(guó)沿海各地采集的鲾科魚類進(jìn)行分類整理和詳細(xì)的形態(tài)測(cè)量,測(cè)定了每一形態(tài)種一定數(shù)量的標(biāo)準(zhǔn)COI序列;結(jié)合GenBank和BOLD中下載的序列,以期突破傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)根據(jù)表型性狀鑒定的局限性,明確中國(guó)鲾科魚類的分類地位,為保護(hù)鲾科魚類生物多樣性和開展海洋生態(tài)調(diào)查提供基礎(chǔ)資料。

        1 材料與方法

        1.1 實(shí)驗(yàn)材料來(lái)源、形態(tài)測(cè)量與數(shù)據(jù)處理

        參閱FishBase、《南海魚類檢索》[3]等資料,將2005—2018年采集于中國(guó)4省14個(gè)地點(diǎn)(表1)的142尾鲾科魚類鑒定為3屬10種,其中小牙鲾(G.minuta)14尾,G.sp.A10 尾,黃斑鲾 14尾,短吻鲾33尾,頸斑鲾26尾,短棘鲾20尾,細(xì)紋鲾(L.berbis)4尾,帶紋鲾(L.striatus) 1尾,堅(jiān)鲾1尾,仰口鲾(S.ruconius)19尾。參照ROHLF等[20]的幾何形態(tài)測(cè)量法,測(cè)量體長(zhǎng)、體高、頭長(zhǎng)、頭高、吻長(zhǎng)、眼徑、尾柄長(zhǎng)、尾柄高、背鰭長(zhǎng)、胸鰭長(zhǎng)、腹鰭長(zhǎng)、臀鰭長(zhǎng)、全長(zhǎng)等13個(gè)常規(guī)性狀;通過(guò)8個(gè)解剖學(xué)坐標(biāo)點(diǎn):A:吻端、B:頭部末端、C:背鰭起點(diǎn)、D:尾鰭背部起點(diǎn)、E:峽部末端、F:腹鰭起點(diǎn)、G:臀鰭起點(diǎn)、H:尾鰭腹部起點(diǎn)構(gòu)建框架結(jié)構(gòu),測(cè)量AB、BC、CD、DH、HG、GF、FE、EA、EB、EC、FB、FC、CG、GD、HC等15個(gè)框架結(jié)構(gòu)測(cè)量性狀間距離,形態(tài)測(cè)量精確到0.1mm。測(cè)量示意圖見圖1。為消除異速生長(zhǎng)帶來(lái)的變動(dòng),將除體長(zhǎng)外的27個(gè)形態(tài)測(cè)量值按ELLIOTT等[21]的方法標(biāo)準(zhǔn)化處理后,通過(guò)SPSS22.0軟件對(duì)27個(gè)度量特征進(jìn)行主成分分析、判別分析和聚類分析。

        1.2 DNA條形碼實(shí)驗(yàn)與數(shù)據(jù)處理

        參照樂(lè)小亮等[22]方法提取魚類樣本DNA。使用本實(shí)驗(yàn)室自行設(shè)計(jì)的引物Cx1F2:5′-ACCTGTGGCAATCACACGCTGAT-3′,Cx1R2:5′-CATGCCCATGTAGCCGAATGG-3′,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,將擴(kuò)增產(chǎn)物送往華大基因測(cè)序。從GenBank和BOLD下載中國(guó)及其鄰近海域鲾科魚類同源序列,通過(guò)MEGA6.0[23]軟件進(jìn)行人工校對(duì),分析序列特征,計(jì)算基于Kimura 2-parameter(K2P)模型的遺傳距離;構(gòu)建鄰接(Neighbor-Joining)樹,經(jīng)1000次重復(fù)抽樣(Bootstraps)檢測(cè)分支置信度。采用自動(dòng)條形碼間隙檢索方法(automatic barcode gap discovery,ABGD)[24]將全部序列自動(dòng)分組。本研究用于條形碼分析的序列如表1所示。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 鲾科魚類形態(tài)測(cè)量多元分析

        對(duì)147 尾 28個(gè)形態(tài)參數(shù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理后,發(fā)現(xiàn)測(cè)量值與標(biāo)準(zhǔn)體長(zhǎng)間無(wú)顯著相關(guān)性,表明成功消除了因異速生長(zhǎng)造成的體長(zhǎng)效應(yīng),使分析結(jié)果更準(zhǔn)確。在主成分分析中,KMO(0.845)值接近1;Bartlett值為5 484.638,27個(gè)形態(tài)特征值種間差異極顯著(P<0.001);說(shuō)明主成分分析結(jié)果較為理想。第1、2主成分的累積貢獻(xiàn)率為65.35%。其中對(duì)主成分1有主要貢獻(xiàn)的是FB、FE、體高等,對(duì)主成分2有主要貢獻(xiàn)的是臀鰭長(zhǎng)、背鰭長(zhǎng)和尾柄長(zhǎng)等。主成分散點(diǎn)圖(圖2)顯示,第一主成分中各種魚類重疊部分較多,因此無(wú)法只通過(guò)主成分1區(qū)分不同魚類;第二主成分中短棘鲾和仰口鲾與其它種類重疊部分較少。逐步判別分析結(jié)果(圖2)顯示,短吻鲾有3尾判入頸帶鲾,2尾判入細(xì)紋鲾,判別成功率為78.8%。頸帶鲾有4尾判入短吻鲾,判別率為84.6%。短棘鲾有1尾判入為帶紋鲾,判別率為95.0%。其余7種魚類判別成功率為100%。在交互驗(yàn)證分析中,G.sp.A、細(xì)紋鲾、仰口鲾判別結(jié)果與逐步判別分析結(jié)果相同,均為100%。堅(jiān)鲾?shù)呐袆e率為0.0%,有且只有1尾判入小牙鲾;短棘鲾判別率為95%,有1尾被判入帶紋鲾;帶紋鲾判別率則為5%,有且只有1尾判入短棘鲾;小牙鲾、黃斑鲾、短吻鲾?shù)慕Y(jié)果低于逐步判別分析結(jié)果。逐步判別分析和交互驗(yàn)證分析的總體判別率分別為91.5%和85.2%。形態(tài)聚類圖上(圖3),短吻鲾與細(xì)紋鲾首先聚類,其次細(xì)紋鲾、小牙鲾、黃斑鲾、仰口鲾、短棘鲾、堅(jiān)鲾依次加入聚類;其中頸帶鲾和短吻鲾、G.sp.A和小牙鲾、帶紋鲾和短棘鲾聚類。

        表1 本研究中用于COI分析的鲾科魚類樣本的信息Tab1 Specimens information of Leiognathidae in the present study

        圖1 鲾科魚類框架結(jié)構(gòu)示意圖(引自中國(guó)臺(tái)灣魚類資料庫(kù))Fig.1 Schematic drawing of morphomertric measurements of Leiognathidae(adopted from fishdb.sinica.edu.tw)注:1:體長(zhǎng);2:體高;3:頭長(zhǎng);4:頭高;5:吻長(zhǎng);6:眼徑;7:尾柄長(zhǎng);8:尾柄高;9:背鰭長(zhǎng);10:胸鰭長(zhǎng);11:腹鰭長(zhǎng);12:臀鰭長(zhǎng);13:全長(zhǎng)。A:吻端;B:頭部末端;C:背鰭起點(diǎn);D:尾鰭背部起點(diǎn);E:峽部末端;F:腹鰭起點(diǎn);G:臀鰭起點(diǎn);H:尾鰭腹部起點(diǎn)。Note:1: body length; 2: body height; 3: head length; 4: head height; 5: snout length; 6: eye diameter; 7: caudal peduncle length; 8: caudal peduncle height; 9: dorsal fin length; 10: pectoral fin length; 11: ventral fin length; 12:anal fin length; 13: full length. A: rostral side; B: head end; C: dorsal fin starting point; D: caudal fin back starting point; E: isthmus end; F: pectoral fin starting point; G: anal fin starting point; H: caudal fin ventral starting point.

        圖2 10種鲾科魚類主成分得分散點(diǎn)圖(左)和判別函數(shù)得分(右)Fig.2 Scatter plot of component factor score (left) and discriminant scores (right) of 10 Leiognathid species

        圖3 基于形態(tài)測(cè)量的鲾科魚類聚類圖Fig 3 Dendrogram of morphological characters of 10 Leiognathid species

        2.2 鲾科魚類線粒體COI序列特征與DNA條形碼分析

        在105條平均長(zhǎng)度為643bp(552~652bp)的序列中,沒(méi)有堿基插入和缺失,多態(tài)位點(diǎn)225個(gè),簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)218個(gè);A、T、C、G堿基組成分別是24.7%、29.0%、28.7%、17.5%。A+T含量(53.7%)高于C+G含量(46.2%),呈現(xiàn)出明顯的堿基組成偏向性,與WARD等[14]的硬骨魚研究一致;顛換比(R)為2.93,大于2.0,表明突變未達(dá)到飽和,適合系統(tǒng)發(fā)育分析。在鄰接樹上(圖4),12種魚聚類成11個(gè)bootstrap支持率為100%分支(Clade),分支間平均遺傳距離[18.6%(7.9%~23.6%)]是分支內(nèi)[0.3%(0.0%~1.0%)]的62倍。黃斑鲾聚類在2個(gè)分支:在Clade1中與短吻鲾混雜,平均遺傳距離為0.2%;在Clade5則無(wú)混雜而獨(dú)立成支。本研究測(cè)序的黃斑鲾L.bindusQ.BoA1、L.bindusQ.SanY1,4、L.bindusQ.HaiW1,3均聚類在Clade 5。曳絲鲾在Clade3中與細(xì)紋鲾混雜,Clade 3進(jìn)一步分為subclade 1和subclade 2,subclade 1與細(xì)紋鲾混雜,subclade 2中曳絲鲾獨(dú)立成支,平均遺傳距離subclade間(5.8%)是subclade分支內(nèi)(0.1%)的58倍。subclade1中細(xì)紋鲾與曳絲鲾種間遺傳距離(0.2%)與種內(nèi)(0.2%)相當(dāng),推測(cè)二者為同種。G.sp.A與小牙鲾種間遺傳距離是種內(nèi)遺傳距離79倍,與寬身小牙鲾是35倍,支持了其為獨(dú)立物種。其余種類單獨(dú)聚類成支。根據(jù)ABGD遞歸分析(圖5),當(dāng)種內(nèi)先驗(yàn)遺傳距離范圍為0.46%~3.59%時(shí),本研究鲾科劃分為12個(gè)假設(shè)種與上述形態(tài)學(xué)與分子結(jié)果分析相對(duì)應(yīng)。另發(fā)現(xiàn)廣東陽(yáng)江堅(jiān)鲾、海南博鰲帶紋鲾、G.sp.A等為3個(gè)新紀(jì)錄種。

        圖4 COI序列K2P模型的鲾科NJ樹Fig4 K2P-based NJ tree of COI sequences of Leiognathidae注:圖中劃線部分為混雜分支Note:The underlined part of the graph are branch intertwined with different species

        圖5 鲾科魚類的ABGD圖Fig.5 Automatic barcode gap discovery analyses of Leiognathidae注:橫坐標(biāo)表示先驗(yàn)種內(nèi)分化值,縱坐標(biāo)表示劃分類群的數(shù)量Note: Abscissa means prior intraspecific divergence, ordinate means the number of groups produced

        3 討論

        3.1 短吻鲾、黃斑鲾和頸帶鲾?shù)姆诸惖匚?/h3>

        DNA條形碼序列用于物種鑒定的一般標(biāo)準(zhǔn)是種內(nèi)遺傳距離通常低于2%,且種間遺傳距離是種內(nèi)遺傳距離的10倍以上[12-14]。在圖3 Clade1中從GenBank下載的黃斑鲾與短吻鲾混雜在平均遺傳距離(0.2%)小于≤2%的Clade1中;但本研究測(cè)定黃斑鲾L.bindusQ.BoA1、L.bindusQ.SanY1,4、L.bindusQ.HaiW1,3均聚類在Clade5上,2個(gè)分支間遺傳距離為18.4%是分支內(nèi)(0.15%)的123倍。因TALWAR等[25]否定了短吻鲾和黃斑鲾為同物異名的可能性,故推測(cè)混雜在Clade1中的黃斑鲾為短吻鲾,ABGD分析也支持這一推測(cè)。短吻鲾和頸帶鲾?shù)谝缓偷诙鞒煞侄茧y以區(qū)分;形態(tài)聚類圖上(圖3)首先獨(dú)自聚類,在判別分析圖中重心沒(méi)有重疊,表明二者表觀形態(tài)較為相似,但也仍具有一些差異,需要仔細(xì)測(cè)量以避免形態(tài)鑒定出錯(cuò)。短吻鲾(Clade1)和頸帶鲾(Clade2)分支間遺傳距離為8.1%是分支內(nèi)(0.15%)的54倍,支持將二者作為獨(dú)立物種的觀點(diǎn)。

        3.2 細(xì)紋鲾與曳絲鲾?shù)姆诸惖匚?/h3>

        細(xì)紋鲾與曳絲鲾間遺傳距離僅為0.2%,不滿足DNA條形碼的分種標(biāo)準(zhǔn)[12-13]。一方面,二者體型相似,體側(cè)均有蠕蟲狀細(xì)紋,區(qū)別僅在于細(xì)紋鲾背鰭第二棘條短于體高,曳絲鲾背鰭第二棘條呈絲狀延長(zhǎng),長(zhǎng)于體高;而魚類捕撈及保存過(guò)程中操作不當(dāng),易使絲狀的棘條殘缺,影響物種鑒定。另一方面,種間生殖隔離機(jī)制薄弱時(shí)易出現(xiàn)雜交情況[26],雜交后代可能會(huì)偏向其中一種親本的形態(tài),而線粒體為母系遺傳,造成鄰接樹上出現(xiàn)不同物種混雜在同一分支上的情況;推測(cè)二者為同種或?yàn)殡s交所致。由于曳絲鲾序列僅為GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)下載,因此需要獲得曳絲鲾標(biāo)本進(jìn)行形態(tài)和DNA條形碼分析,補(bǔ)充測(cè)定核基因序列,并開展生物學(xué)特征研究,方可準(zhǔn)確判斷物種分類地位。

        綜上所述,本研究鑒定了中國(guó)常見10種鲾科魚類,表明DNA條形碼能夠用于快速鑒定鲾科魚類。由于線粒體為母系遺傳,不能區(qū)分雜交物種,因而對(duì)于混雜成支的種類,需要進(jìn)行詳細(xì)形態(tài)特征的統(tǒng)計(jì)分析,并使用雙親遺傳的核基因標(biāo)記綜合分析。由于本研究仍未能涉及所有中國(guó)鲾科魚類物種,今后應(yīng)擴(kuò)大采樣范圍,增加樣品種類及數(shù)量,并妥善保存樣本的鱗式及鰭式等性狀特征,以進(jìn)一步明確中國(guó)鲾科魚類的分類地位,為中國(guó)海洋漁業(yè)調(diào)查、種質(zhì)資源的管理和開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

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