常曉晴，王 元，英 娜，李楠英，黃 倞，李新蒼，周俊芳，房文紅

(1．中國水產(chǎn)科學研究院東海水產(chǎn)研究所,農(nóng)業(yè)部東海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點實驗室，上海 200090； 2．上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院，上海 201306)

蝦肝腸胞蟲(Enterocytozoonhepatopenaei，簡稱EHP)是一種主要侵染對蝦肝胰腺細胞并在其內(nèi)形成孢囊結構的微孢子蟲。最初，2001年CHAYABURAKUL等[1]在研究泰國斑節(jié)對蝦(Penaeusmonodon)生長緩慢疾病時首次檢測到EHP，但未對其進行描述和命名，隨后，TOURTIP等[2]對其組織病理、超微結構以及系統(tǒng)進化等方面進了研究，并正式命名。近幾年，國內(nèi)外許多地區(qū)如泰國[3]、越南[4]、印度[5]、中國[6-7]、馬來西亞[8]以及印度尼西亞[9]等均發(fā)現(xiàn)和報道了該寄生蟲的暴發(fā)流行。EHP的宿主除斑節(jié)對蝦外，已確認的還有藍對蝦(Penaeusstylirostris)以及凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)。多數(shù)研究者認為EHP與凡納濱對蝦生長遲緩有關[10-11]，且對全球凡納濱對蝦產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展已造成嚴重威脅。

病理診斷是目前臨床醫(yī)學中最可靠的一種定性診斷，具有其它檢查無法替代的權威性，被譽為疾病診斷的“金標準”[12]，而組織石蠟切片是病理診斷中最常用的一種手段。組織染色是利用各種特定染料與組織細胞中不同成分結合反應而使其呈現(xiàn)出不同顏色，是組織切片制作中一個至關重要的環(huán)節(jié)，染色質(zhì)量的好壞將直接影響最終的觀察效果，是檢出病原以及準確反映病理變化的關鍵。由于蝦肝腸胞蟲是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種對蝦病原，有關該寄生蟲病的特殊染色方法的研究較少，本研究比較了蘇木精-伊紅(HE)染色法、Masson染色法、愛顯藍-雪夫(AB-PAS)染色法、甲苯胺藍(TB)染色法、偉郝夫范吉森(EVG)染色法、勞克堅牢藍(LFB)染色法、天狼猩紅(Sirius red)染色法和普魯士藍(PB)染色法對凡納濱對蝦肝胰腺中蝦肝腸胞蟲的染色效果，以便篩選出穩(wěn)定、準確、清晰的染色方法，為蝦肝腸胞蟲病的診斷及其病理研究提供更有效的檢測手段。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與處理

樣品為2016年上海郊區(qū)養(yǎng)殖場采集的疑似患病凡納濱對蝦活體，取其肝胰腺組織投入Davidson’s AFA固定液中，固定24 h后換液一次。固定的組織塊經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明和石蠟包埋后進行連續(xù)切片，厚度約5 μm。切片經(jīng)二甲苯脫蠟再經(jīng)梯度乙醇脫水后，采用不同染色方法染色，最后常規(guī)脫水、透明、封片。

1.2 染色方法

1.2.1 蘇木精-伊紅(HE)染色法

參考BELL[13]的方法，稍作改進：切片入Harris蘇木素染5 min，流水沖洗5 min；含1%鹽酸酒精(99份無水乙醇+1份濃鹽酸)分化數(shù)秒，流水沖洗；0.6%氨水返藍，流水沖洗。然后，切片入伊紅染液中染色3 min。

1.2.2 Masson染色法

參考GOLDNER[14]的方法，稍作改進：切片用Weigert氏鐵蘇木素液染5 min，流水沖洗；含1%鹽酸酒精分化數(shù)秒，流水沖洗數(shù)分鐘返藍，麗春紅酸性品紅液染8 min，蒸餾水快速漂洗；磷鉬酸水溶液處理約4 min，苯胺藍液復染5 min，1%冰醋酸分化1 min。

1.2.3 愛顯藍-雪夫(AB-PAS)染色法

參考黃云梅等[15]的方法，稍作改進：切片入阿利新藍染液浸染10 min，稍水洗，0.5%高碘酸水溶液氧化10 min，流水沖洗數(shù)分鐘后再用蒸餾水漂洗兩次，再用雪夫試劑暗處浸染20 min，流水沖洗10 min。

1.2.4 甲苯胺藍(TB)染色法

參考吳敏等[16]的方法，切片用甲苯胺藍染液染色10 min，95%乙醇分化1 min，風干后封片。

1.2.5 偉郝夫范吉森(EVG)染色法

參考胡曉磊等[17]的方法，Verhoeff’s染液染20 min，至顏色呈深黑色，流水沖洗，2%三氯化鐵溶液分化10～20 s，流水沖洗，5%硫代硫酸鈉溶液處理1 min清除多余碘，流水沖洗后再蒸餾水漂洗2次；Van Gieson’s液復染5 min，無水乙醇漂洗1 min。

1.2.6 勞克堅牢藍(LFB)染色法

參考張麗等[18]的方法，稍作改進，切片置于0.1% LFB染液60 ℃ 孵育過夜，流水沖洗；浸入70%乙醇中30 min；浸入0.05% 碳酸鋰中分色約1 min，流水沖洗；0.1%伊紅復染1 min，流水沖洗5 min。

1.2.7 普魯士藍(PB)染色

參考董鴻瑞等[19]的方法，切片入2%亞鐵氫化鉀和2%鹽酸混合染液(1∶1)中染色20 min；流水沖洗2 min，蒸餾水洗，0.1%核固紅染液復染10 min，蒸餾水洗5 min。

1.2.8 天狼猩紅染色

參考沈薔等[20]的方法，稍作改進，切片入飽和苦味酸天狼猩紅染色液內(nèi)染色8 min，無水乙醇漂洗約1 min，風干后封片。

1.3 顯微觀察及數(shù)據(jù)分析

制備的切片用Olympus BX51多功能顯微鏡在1 000倍下觀察，Image-Pro Plus 5.1軟件拍照，圖像采集分析。

EHP的檢出率是將每種染色方法染色后的切片均在顯微鏡400倍下觀察，觀察記錄每個視野下所有肝小管，和被感染肝小管的數(shù)量。定義：檢出率=單個視野鏡檢EHP感染肝小管數(shù)量/單個視野鏡檢的肝小管數(shù)量，視野內(nèi)含肝小管結構的一半及以上視為一個肝小管。采用兩種方法計算檢出率：方法一：同位置法，8張連續(xù)切片分別用8種染色方法染色后在400倍鏡下，觀察4個相同位置，進行統(tǒng)計，計算檢出率；方法二： 隨機法，8種染色方法對應的連續(xù)切片上，隨機取4個視野，統(tǒng)計檢出率。因HE染色為常規(guī)染色方法，本次統(tǒng)計學分析使用HE染色檢出率的平均值為檢驗值，其它染色組樣本與HE染色樣本進行單樣本t檢驗，使用SPSS 19.0軟件統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 HE染色效果

凡納濱對蝦肝胰腺組織中肝小管的基膜呈粉紅色，管壁細胞層中各類細胞核呈現(xiàn)藍紫色，細胞核核膜及核仁邊緣光滑，邊界清晰，胞漿呈現(xiàn)深淺不同的粉紅色，細胞整體的形態(tài)結構染色清晰。蝦肝腸胞蟲孢囊整體形狀輪廓較清晰，其內(nèi)大量孢子在宿主細胞中呈現(xiàn)出顆粒感，孢子被染成粉紅色，與細胞漿背景顏色相比，染色稍深，但不易區(qū)分，單個孢子形狀不清晰，似卵圓形(圖版I-1)。

2.2 Masson染色效果

宿主肝小管的基膜呈藍靛色，細胞核著色深，尤其是核仁呈深紅色，核膜與胞漿邊界清晰，細胞漿呈現(xiàn)深淺不同的藍灰色。蝦肝腸胞蟲孢囊整體形狀輪廓清晰，其內(nèi)大量孢子在宿主細胞中呈現(xiàn)出強烈的顆粒感，孢子被染成妃紅色或品紅色，與宿主細胞核相比染色稍淺，但與細胞漿顏色差異明顯，背景清晰，易辨別，且單個孢子的形狀較清晰，為橢圓形，更接近濕涂片中新鮮孢子的形狀(圖版I-2)。

2.3 AB-PAS染色效果

宿主肝小管基膜呈現(xiàn)絳紫色，各細胞邊界模糊，不易區(qū)分，且細胞核與細胞漿均呈現(xiàn)淡醬紫色，細胞形態(tài)結構不清晰。蝦肝腸胞蟲孢囊整體形狀輪廓不清晰，其內(nèi)大量的孢子雖表現(xiàn)出顆粒感，但孢子形態(tài)模糊，雪夫試劑將孢子染成淡紅色，與背景顏色對比差異不明顯，不易辨別(圖版I-3)。

2.4 TB染色效果

宿主肝小管基膜、細胞漿均呈淺藍色，細胞核形態(tài)不清晰，核仁染色深，核膜與細胞漿邊界模糊。強嗜堿性細胞整個被染成深藍色。蝦肝腸胞蟲孢囊整體形狀輪廓清晰，其內(nèi)大量孢子呈現(xiàn)較強的顆粒感，多數(shù)孢子被染成紫紅色或深藍色，形狀較清晰，與背景顏色對比差異較明顯，少數(shù)孢子染色后與背景顏色差異不明顯，不易分辨(圖版I-4)。

2.5 EVG染色效果

宿主肝小管基膜和細胞漿均呈現(xiàn)灰黃色，各細胞細胞核邊界清晰，核仁呈現(xiàn)黃黑色。強嗜堿性細胞整個呈現(xiàn)深黑灰色。蝦肝腸胞蟲孢囊整體形狀輪廓較清晰，孢子呈現(xiàn)藍灰色，與背景顏色對比差異不明顯，形態(tài)模糊，顆粒感差，不易辨別(圖版I-5)。

2.6 LFB染色效果

宿主肝小管基膜、各細胞的細胞漿和細胞核均呈青藍色，顏色一致，細胞形態(tài)結構不能辨別。蝦肝腸孢蟲包囊輪廓無法辨識，部分孢子呈藍色，部分孢子呈不透明的黑色，與背景顏色相比差異極明顯，分散在細胞漿中孢子表現(xiàn)出強烈的顆粒感，但整個切片中，孢子數(shù)量相對較少(圖版I-6)。

2.7 PB染色效果

宿主肝小管基膜、各細胞的細胞漿均呈淡粉紅色，各細胞形態(tài)模糊，但細胞核形狀清晰，核仁呈粉紅色。蝦肝腸胞蟲孢囊輪廓模糊，孢子形態(tài)模糊，無顆粒感，與背景顏色無差異，難辨別(圖版I-7)。

2.8 天狼猩紅染色效果

宿主肝小管基膜呈淡紅色，各細胞均呈黃色，且形態(tài)結構模糊。蝦肝腸胞蟲孢囊輪廓模糊，孢子形態(tài)模糊，難辨別(圖版I-8)。

2.9 檢出率

2.9.1 同位置視野檢出率結果

2.9.2 隨機視野檢出率結果

對隨機位置法檢出率進行t檢驗的結果如表2所示。

上述兩種不同統(tǒng)計方法得出的EHP孢子檢出率，均以Masson染色最高，LFB染色次之。

3 討論

特殊染色法是病理學研究常用的方法之一，也是臨床病理診斷中重要的輔助技術之一。特殊染色技術具有特異、簡單、快捷、廉價等顯著優(yōu)點，并且這些技術也在發(fā)展和完善，至今還沒有出現(xiàn)更好的能完全替代它的直接顯示細胞內(nèi)外特殊化學物質(zhì)的簡便易行的方法和技術。但其在組織病理分析時耗時較長，對實驗人員的專業(yè)經(jīng)驗要求較高，并且在水產(chǎn)生物輕微感染微孢子蟲時易診斷失敗。微孢子蟲病的石蠟切片染色是其病原檢測的基礎，但是不同的染色技術在其形態(tài)學觀察中的作用卻不甚明確，因此本實驗對比了8種染色技術對蝦肝腸胞蟲的染色效果。

表1 8種染色方法對蝦肝腸胞蟲孢子檢出率結果的統(tǒng)計學分析(同位置視野)Tab.1 Statistical analysis of the detection rate of 8 staining methods for EHP (the same scan filed)

注：*表示P<0.05

Note：*meansP<0.05

表2 8種染色方法對蝦肝腸胞蟲孢子檢出率結果的統(tǒng)計學分析(隨機視野)Tab.2 Statistical analysis of the detection rate of 8 staining methods for EHP (random scan filed)

注：*表示P<0.05

Note：*meansP<0.05

對蝦肝腸胞蟲是近年來的新發(fā)現(xiàn)病原之一，有關該寄生蟲病的特殊染色方法的研究較少，目前國內(nèi)外多數(shù)研究者采用常規(guī)的蘇木素-伊紅(HE)染色法。HE染色技術是病理技術中最經(jīng)典的染色方法，是由WALDEYER于1863年首先提出來的，一直沿用至今。RAJENDRAN等[5]利用 HE染色法分別對凡納濱對蝦肝胰腺組織中的孢子和純化后的孢子進行了染色，結果表明，純化后的孢子染色效果明顯優(yōu)于組織中的孢子染色效果，這說明肝胰腺組織對HE染色法檢測EHP產(chǎn)生干擾。SALACHAN等[3]對比了HE染色和原位雜交技術對肝胰腺組織中EHP的檢測效果，發(fā)現(xiàn)在低倍鏡下，HE染色切片中EHP不能被識別出，而原位雜交切片中EHP則易被檢出，故認為后者比HE染色更可靠，但此法耗時長、成本高。本研究也發(fā)現(xiàn)，雖然HE染色對肝胰腺組織細胞的染色效果不錯，但對孢子著色較淺，與背景顏色接近，在低倍鏡下孢子的辨識度低，特別是在孢子數(shù)量較少、孢囊較小的時候，更不易與肝胰腺組織區(qū)分，不仔細觀察而易造成漏檢，影響診斷結果的準確性，綜合分析效果并非最優(yōu)。

Masson染色方法的原理是利用鐵蘇木素著色細胞核，利用酸性品紅和苯胺藍著色胞漿，從而使組織不同成分顯示不同顏色。該法在診斷慢性炎癥、纖維性腫瘤以及肝、腎、心臟等機體纖維化病變中具有重要應用[21]。通常情況下，組織多采用甲醛固定，經(jīng)Masson染色后胞漿為紅色，細胞核為藍色(苯胺藍復染)或綠色(亮綠復染)。而本研究中，對蝦肝胰腺組織為Davidson’s AFA液固定，經(jīng)染色后，胞漿呈藍灰色，細胞核核仁呈深紅色，這種明顯的差異很可能與固定試劑的不同有關。黃利等[22]研究了不同固定液對Masson染色結果的影響，發(fā)現(xiàn)Bouin氏液固定的組織細胞核、胞漿染成紫紅色，而10%甲醛固定的組織細胞核染成綠色，胞質(zhì)染成紫紅色。這表明不同固定液對 Masson 染色結果影響較大。本文中，宿主細胞核、胞漿、基膜均呈不同顏色，結構清晰易辨別，說明對宿主的組織細胞染色效果Masson染色法與HE染色法兩者差別不明顯；而經(jīng)Masson染色后的孢子呈鮮艷紅色，與背景對比鮮明，雖然孢子顏色和與宿主細胞核核仁顏色接近，但前者形態(tài)呈小顆粒橢圓形，且數(shù)量多，似石榴籽，后者呈圓形，單個體積大，周圍空白，外圍有核膜包圍，二者形態(tài)結構差異大，容易區(qū)分。Masson染色結果顯示組織結構清晰，對比鮮明，顆粒清晰可見，此方法既能檢出肝胰腺組織中的大量孢子，又能將宿主的各細胞形態(tài)結構清晰顯示，彌補了HE染色的不足，說明Masson染色法對蝦肝腸胞蟲的染色效果優(yōu)于HE染色法。本文系首次將Masson染色應用于微孢子蟲病研究。

AB-PAS染色是綜合利用阿利新藍染色和常規(guī)PAS染色兩者的優(yōu)點，可檢測組織中的糖原、中性粘多糖、酸性粘多糖以及真菌[23]等物質(zhì)成分。組織中的糖類成分與染色劑中的過碘酸發(fā)生作用，產(chǎn)生出游離的醛基再與無色堿性品紅反應而顯示出紫紅色；而組織中的酸性粘液物質(zhì)與水溶性的堿性染料AB反應而顯示為藍色，從而使紅色的PAS反應物和藍色的AB反應物同時呈現(xiàn)在一張切片中。肝胰腺是對蝦機體代謝重要器官，是糖原儲存的主要場所之一，因而PAS染色反應可將其內(nèi)糖原物質(zhì)染成紅色，而EHP屬于真菌類生物，其孢子的孢壁中含有與真菌細胞壁類似的多糖類物質(zhì)，經(jīng)染色也同樣呈現(xiàn)紫紅色，因而背景與病原顏色差異小，不利于觀察。

甲苯胺藍是一種具有異染性的堿性染料，含有發(fā)色團和助色團，一般組織細胞中的細胞核等酸性成分被染成為與染料本色相同的藍色，而特殊的細胞，如肥大細胞，該細胞漿內(nèi)充滿許多粗大的嗜堿性顆粒，這種顆粒因含有肝素、組胺等具異染性的成分而被染成與染料本色相異的紫紅色[16]。本文中蝦肝腸胞蟲的部分孢子也被染成紫紅色，這說明孢子中也含有異染性的成分，在400倍鏡下紫紅色的孢子與背景藍色對比并不明顯。而TOURTIP等[2]發(fā)現(xiàn)EHP孢子經(jīng)甲苯胺藍染色后顏色為均一的深藍色，此現(xiàn)象與本文結果不一致，這可能與固定液不同有關，后者使用的是戊二醛固定液，可能戊二醛與孢子發(fā)生作用，致使孢子中的異染性物質(zhì)發(fā)生改變。

EVG染色法也是一種用于顯示彈力纖維和膠原纖維的病理診斷方法，經(jīng)EVG染色后，彈力纖維和細胞核呈黑色，膠原纖維呈紅色，從而區(qū)分及判斷這兩類纖維的病變情況[24]。本實驗中，該染色方法雖然能顯示細胞的基本結構，但對EHP孢子染色效果不好，容易造成漏檢。

LFB染色是一種常用的顯示髓鞘的染色方法[25]，本實驗中，肝胰腺組織被染成淡藍色，而EHP孢子變成黑色，這可能是其與勞克堅牢藍結合不緊密造成的，在乙醇和碳酸鋰分化過程中，孢子褪至無色，以致其與背景色差界限明顯。雖然散落的孢子在光鏡下極易識別出，但是，EHP孢囊結構在染色過程中被破壞，孢子似部分丟失，形態(tài)也不均一，而且背景中無法區(qū)分組織細胞結構。

天狼腥紅作為一種強酸性染料，普遍應用于人或動物肝、腎等臟器纖維化病變的染色[26]，通常需要與偏光鏡結合使用才能發(fā)揮出其作用，本文分別于普通光學顯微鏡下和偏振光顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)EHP孢子在兩者視野中均與背景無區(qū)別。

普魯士藍染色多用于檢測人類肝、腎臟的鐵血黃素沉積，鐵血黃素顆粒與染液發(fā)生反應而呈現(xiàn)藍色，而其它的細胞成分則被染成淺紅色[19,27]，本文中對蝦肝胰腺組織及EHP均被染成淡粉紅色，未發(fā)現(xiàn)藍色成分。

與前述6種染色方法相比，普魯士藍和天狼腥紅染色后，在脫色過程中，肝胰腺組織與孢子同步脫色，最終兩者顏色反差不大，孢子的形態(tài)不再可辨。

通過鏡檢發(fā)現(xiàn)，孢子與背景顏色差異效果在低倍鏡下(40×物鏡)比高倍鏡(100×物鏡，圖版I)下差，而400倍又是常用的研究組織病理的放大倍數(shù)，并且單個視野下大約包含15個肝小管，適于數(shù)據(jù)采集。因此我們選擇400倍作為檢出率的評價標準，在此放大倍數(shù)下如果孢子與背景顏色對比明顯，易于識別，則孢子的檢出率高，不同染色方法使孢子在400倍鏡下的可見性也側(cè)面印證了該染色方法的優(yōu)劣，可進一步證實染色方法的可靠性。通過連續(xù)切片發(fā)現(xiàn)，宿主細胞內(nèi)的孢子形成的團塊形狀變化較大，大小一般約為5～10 μm, 而切片厚度為5 μm, 一個孢子團在經(jīng)歷1～2次連續(xù)切片后往往在第二或第三個連續(xù)切片上消失了，導致同一個肝小管在連續(xù)切片上孢子的檢出率并不相同，為避免這種情況造成的統(tǒng)計誤差，我們選擇隨機方法對檢出率再次統(tǒng)計。

統(tǒng)計學結果中P<0.05時表示該染色方法與HE染色法具有明顯差異，除了AB-PAS染色法之外的其它6種染色方法都與HE染色法有顯著性差異。其它染色法與HE染色法進行單樣本t檢驗的t值為正值時表示孢子染色檢出率高于常規(guī)HE染色法，當t值為負值時則相反。結果表明，Masson染色的孢子檢出率最高，在蝦肝腸胞蟲組織切片檢測中具有明顯優(yōu)勢；LFB在檢出率上雖優(yōu)于HE染色，但該染色方法可能存在破壞孢囊結構的現(xiàn)象，因此不適用于病理變化分析；其它4種染色方法的EHP檢出率均低于HE染色法，其中PB染色和天狼腥紅染色的t值為絕對值最大的負值，表示兩者在蝦肝腸胞蟲染色上效果最差。

綜上所述，所列8種染色方法對蝦肝腸胞蟲的染色各有優(yōu)缺點，其中Masson染色法效果最優(yōu)，因此，Masson染色可用于微孢子蟲臨床病理診斷和病理組織學研究。

圖版I 不同染色方法下的肝胰腺組織及蝦肝腸胞蟲孢子
Fig 1 Hepatopancreas tissue and spores of EHP under different staining methods
注：1，HE染色；2，Masson染色；3，AB-PAS 染色；4，TB染色；5，EVG染色；6，LFB染色；7，PB染色；8，天狼腥紅染色。B：基膜，N：細胞核，S：孢子。所有標尺=10 μm。
Note：1, HE staining; 2, Masson staining; 3, AB-PAS staining; 4, TB staining; 5, EVG staining; 6, LFB staining; 7, PB staining; 8, Sirius red staining; B: Basilar membrane; N: Nucleus; S: Spores. All scale bars =10 μm.