楊佰啟， 溫貴蘭*， 陳彥希， 田 浪， 張升波，徐 麗， 李昌紅， 龔新勇， 文 明， 周碧君， 張 軍.3

(1.貴州大學動物科學學院，貴州 貴陽 550025； 2.貴州省動物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點實驗室， 貴州 貴陽 550025； 3.貴州省六盤水市動物衛(wèi)生監(jiān)督所，貴州 六盤水 553000)

病原沙門氏菌屬(Salmonella)為寄生于人和動物腸道內(nèi)的無芽孢桿菌，是一大屬與血清學相關的革蘭氏陰性桿菌[1]。SALMON于1985年分離出沙門氏菌屬的豬霍亂桿菌，因此定名沙門氏菌屬Salmonella[2]。目前，沙門氏菌屬有2個種，42個血清群，2 500個血清型以上，我國已報道的血清型達240種以上[3]，其中與家禽密切相關的有40余種。雞沙門氏菌病(AvianSalmonellosis)是由多種沙門氏菌引起的一類傳染病的總稱，其中引起雞發(fā)病的沙門氏菌主要有雞白痢沙門氏菌、雞傷寒沙門氏菌及有鞭毛能運動的多種副傷寒沙門氏菌[4]；大多數(shù)禽類對沙門氏菌病易感，以3周齡以內(nèi)雛雞的發(fā)病率與病死率最高，4周齡后的發(fā)病率和死亡率顯著下降[5]。臨床上多表現(xiàn)為敗血癥和腸炎，少數(shù)表現(xiàn)為關節(jié)炎；雞沙門氏菌病對養(yǎng)雞業(yè)的危害較大，會導致雞的生產(chǎn)性能下降，種蛋的孵化率降低。目前，我國控制該病的主要措施是檢疫淘汰帶菌雞，凈化培育雞群；對于一些沒有條件凈化或短期內(nèi)無法凈化的雞群采用抗菌藥物預防和治療[6-7]。筆者等2018年11月對貴州某肉雞養(yǎng)殖場送檢的病雞進行細菌分離培養(yǎng)鑒定，通過藥敏試驗篩選出分離菌株的敏感藥物，并進行分離菌株16S rRNA基因序列分析鑒定，確診送檢病雞為雞沙門氏菌感染，對該雞場雞沙門氏菌的防控具有指導作用。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1病料與健康雛雞病料5份，來源于貴州某肉雞養(yǎng)殖場處于3～4周齡發(fā)病的5只雛雞。健康雛雞8只，購自貴州某肉雞養(yǎng)殖場。

1.1.2主要試劑普通肉湯瓊脂平板、普通肉湯液體培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基(MAC)、亞硫酸鉍(BS)瓊脂平板、革蘭氏染色劑、抗菌藥物(紅霉素、先鋒霉素、頭孢曲松、環(huán)丙沙星、丁胺卡那、新霉素、氯霉素、慶大霉素、多黏霉素、克林霉素、四環(huán)素、萬古霉素、諾氟霉素、卡那霉素、青霉素)、革蘭氏染色劑、生化管，均購自杭州微生物試劑公司；2×Es Taq DNA polymerase，購自康為世紀；DL 2000 DNA Marker，購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2方法

1.2.1細菌分離培養(yǎng)無菌采集病雞關節(jié)液，用接種環(huán)接種于普通肉湯瓊脂培養(yǎng)基，分別在需氧與厭氧條件下37℃培養(yǎng)24 h后，觀察細菌菌落特征。挑取可疑單個菌落分別接種于麥康凱培養(yǎng)基(MAC)、亞硫酸鉍(BS)瓊脂平板上。

1.2.2細菌革蘭氏染色取50 μL純培養(yǎng)菌液均勻涂抹于干凈載玻片上，經(jīng)火焰固定、草酸結晶紫初染、碘液媒染、脫色液脫色、沙黃復染后，于10×100倍油鏡下觀察細菌形態(tài)。

1.2.3細菌生化試驗用接種環(huán)分別接種純培養(yǎng)菌液于麥芽糖、葡萄糖、甘露醇、甲基紅、吲哚(靛基質(zhì))、乳糖生化管中，37℃培養(yǎng)48 h后觀察記錄結果。

1.2.4細菌藥敏試驗吸取100 μL純培養(yǎng)菌液均于涂抹于瓊脂平板上，用紙片法將15種藥敏片粘貼于平板上，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，記錄藥敏片的抑菌圈大小，參照美國臨床和實驗室標準化協(xié)會(CLSI 2016)抗微生物藥物敏感試驗標準進行藥物敏感性判斷。

1.2.5分離菌株感染雛雞試驗將8只健康雛雞平均分為2組，試驗組肌肉注射200 μL菌液，對照組肌肉注射200 μL生理鹽水，隔離飼養(yǎng)，觀察雛雞發(fā)病和死亡情況，采集關節(jié)液接種于普通肉湯瓊脂培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h，挑取單個菌落涂片鏡檢。

1.2.6分離菌株16S rRNA PCR 擴增及測序細菌16S rRNA引物序列，F(xiàn)：5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′；R：5′-AAGGAGGTGATCCAGCC-3′，引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司測序合成。PCR反應體系20 μL：上游引物0.5 μL，下游引物 0.5 μL，菌液 2 μL，2×Es Taq DNA polymerase 10 μL，ddH2O 7 μL。PCR反應條件：94℃預變性2 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸90 s，共30個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR反應結束后經(jīng)1.2%瓊脂凝膠電泳檢測PCR反應產(chǎn)物，并將產(chǎn)物送英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司測序。

1.2.7分離菌株16S rRNA基因序列分析將分離菌株的16S rRNA基因序列與GenBank 數(shù)據(jù)庫中收錄的序列進行比對，運用DNAStar 7.0軟件的MegAlign將測序的16S rRNA基因序列與腸桿菌科沙門氏菌屬、大腸桿菌屬共17個菌株(表1)的16S rRNA基因序列比對，并應用MegAlign軟件的Cluster W方法構建遺傳進化樹。

表1 比對菌株信息

2結果與分析

2.1細菌分離培養(yǎng)

接種分離菌37℃培養(yǎng)24 h后，在亞硫酸鉍瓊脂平板上顯示黑色并有金屬光澤的菌落，菌落周圍培養(yǎng)基不變；在麥康凱瓊脂平板上生長成無色、半透明、表面光滑的圓形小菌落(圖1)。該菌在2種平板上生長的菌落形態(tài)均符合沙門氏菌的生長特性。

圖1亞硫酸鉍瓊脂培養(yǎng)基(上)與麥康凱瓊脂培養(yǎng)基(下)培養(yǎng)分離菌的特征

Fig.1 Characteristics of the isolated strain cultured on Bismuth sulfite agar medium (up) and Mackenzie agar medium (down)

2.2細菌革蘭氏染色與生化反應

分離菌經(jīng)革蘭氏染色，鏡檢為革蘭氏陰性、兩端鈍圓的短桿菌(圖2)，符合沙門氏菌屬革蘭氏染色的細菌形態(tài)。經(jīng)生化試驗，分離菌可以發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、甘露醇，產(chǎn)酸產(chǎn)氣；不發(fā)酵乳糖，甲基紅試驗陽性(+)，吲哚(靛基質(zhì))弱陽性(+/-)，符合沙門氏菌的生化反應特征。

圖2 細菌革蘭氏染色結果

2.3分離菌的藥物敏感性

從表2看出，分離菌對紅霉素、頭孢曲松、環(huán)丙沙星、丁胺卡那、氯霉素、慶大霉素和多黏霉素高度敏感；對先鋒霉素V、新霉素和克林霉素中度敏感；對青霉素、四環(huán)素、萬古霉素、諾氟霉素和卡那霉素不敏感(產(chǎn)生耐藥性)。

表2分離菌對15種抗菌藥物的敏感性

Table 2 Sensibility of the isolated strain to 15 antibacterial agents

藥物名稱Drug name抑制菌圈直徑大小/mmDiameter of inhibition zone判定結果Evaluation result紅霉素 Eryphilin30高度敏感先鋒霉素V Pioneer V20中度敏感青霉素 penicillin10不敏感四環(huán)素 tetracycline12不敏感頭孢曲松 Ceftriaxone 46高度敏感克林霉素 Clindamycin15中度敏感萬古霉素 Vancomycin10不敏感環(huán)丙沙星 Ciprofloxacin24高度敏感丁胺卡那 Amikacin30高度敏感新霉素 Neomycin20中度敏感氯霉素 Chloramphenicol40高度敏感慶大霉素 Gentamicin25高度敏感諾氟霉素 Norfomycin12不敏感卡那霉素 Kanamycin10不敏感多黏霉素B Polymyxin B23高度敏感

2.4雛雞感染試驗

試驗組雛雞感染分離菌3 d后，病雞表現(xiàn)精神沉郁，食欲不振，病初喜臥，隨后出現(xiàn)跛行，一側或雙側關節(jié)出現(xiàn)腫大。剖解病雞關節(jié)腔、腿肌及腹腔，可見腿肌處淡黃色滲出液，關節(jié)及附近滑液囊高度腫大，與之相連接的腱鞘發(fā)炎腫大，關節(jié)腔內(nèi)有黃色或淡黃色的液體滲出，囊壁增厚，腹腔內(nèi)有大量淡黃色積液，心包膜增厚。對照組7 d無異?，F(xiàn)象。接種試驗組雛雞分離菌涂片鏡檢，與沙門氏菌的形態(tài)特征一致，證明導致雛雞感病的病原為沙門氏菌。

2.5分離菌株16S rRNA基因PCR擴增與及測序

從圖3可知，分離菌株的16S rRNA基因 PCR擴增片段約為1 300 bp。目的條帶測序得到分離菌株16S rRNA基因的部分序列，大小為950 bp，命名該菌株為GZ2018。

注：M為2000 DMarker，1為分離菌株，2為陰性對照。

Note: M. 2000 D marker; 1. The isolated strain; 2. Negative control.

圖3分離沙門氏菌的16SrRNAPCR擴增圖譜

Fig.3 16S rRNA PCR amplification pattern of the isolatedSalmonellastrain

2.6沙門氏菌GZ2018的16S rRNA基因序列

2.6.1同源性從圖4看出，沙門氏菌GZ2018與沙門氏菌屬和大腸桿菌屬的17株細菌16S rRNA基因序列同源性為40.9%～100%，其中，GZ2018與腸炎型沙門氏菌CQ0709、NBRC 3163和Sal1203的同源性最高，均為100%；與Anatum GT-01株的同源性最低，僅40.9%。

圖4沙門氏菌GZ2018的16S rRNA基因序列同源性對比

2.6.2系統(tǒng)進化樹從圖5可知，Anatum GT-01和Mbandaka.ATCC51958單獨為一支，其中腸炎型沙門氏菌CQ0709與GZ2018處于同一分支，進化關系最近，進一步驗證GZ2018為沙門氏菌。

圖5GZ2018株16S rRNA序列系統(tǒng)進化樹

Fig.5 Phylogenetic tree of 16S rRNA sequence ofSalmonellaGZ2018 strain

3結論與討論

禽沙門氏菌病(PulourmDisease)是由沙門氏菌屬中任何一個或多個成員所引起禽類的一種急性或慢性疾病。該病除水平傳播外，主要通過卵傳遞，是貫穿整個養(yǎng)雞周期的一種惡性循環(huán)式疾病[8]。病雛雞以白痢為特征，雛雞常表現(xiàn)急性敗血癥和腸炎型，病程短，死亡率很高，治療主要以緊急接種為主；關節(jié)炎型為慢性發(fā)病，臨床上有治療意義，死亡率可以控制在最小范圍內(nèi)[9]。

通過細菌的分離培養(yǎng)、形態(tài)觀察、生化試驗、雛雞的致病性試驗、PCR反應以及16S rRNA基因序列分析，確認從發(fā)病雛雞關節(jié)囊腫分離的細菌為沙門氏菌。發(fā)生雞關節(jié)炎性疾病的病原體較多，有細菌性、病毒性和支原體；常見的病毒性關節(jié)炎有呼腸孤病毒(ARV)，細菌性主要有大腸桿菌、沙門氏菌、巴氏桿菌等，支原體性有滑液囊支原體。各種關節(jié)性疾病通過肉眼難以分辨，為明確病因必需進行實驗室診斷確診[5]。試驗從貴州某肉雞養(yǎng)殖場3～4周齡發(fā)病雛雞中分離出致病株，分離菌對紅霉素、頭孢曲松、環(huán)丙沙星、丁胺卡那、氯霉素、慶大霉素和多黏霉素高度敏感；對先鋒霉素V、新霉素和克林霉素中度敏感；對青霉素、四環(huán)素、萬古霉素、諾氟霉素和卡那霉素不敏感，表明該菌已對多種抗生素產(chǎn)生了耐藥性，在臨床用藥時應該注意聯(lián)合用藥和穿梭用藥。

分離株16S rRNA 基因核苷酸序列與GenBank中其他沙門氏菌的16S rRNA基因序列同源性達94.6%以上，其中，與CQ0709(GenBank：FJ465088.1)、NBRC 3163(GenBank:AB680018.1)和Sal1203(GenBank：JX888138.1)的同源性為100%；分離菌株與腸炎型沙門氏菌CQ0709(GenBank：FJ465088.1)處于同一小分支上，進化關系最近。綜上所述，貴州某肉雞養(yǎng)殖場3～4周齡雛雞由腸炎型沙門氏菌感染導致發(fā)病。腸炎型沙門氏菌引起雛雞常見的癥狀有精神沉郁、食欲不振、腿軟、下痢，病程稍長者可引起嚴重脫水；剖解常見心冠脂肪出血、心包積液，有些肝臟有灰白壞死點，腸道腫大充血、出血[10]；對于腸炎型沙門氏菌引起關節(jié)炎型的病例較為少見，故此在臨床診斷時應把腸炎型沙門氏菌納入考慮范圍，再結合實驗室診斷做出準確的判斷，繼而在短時間內(nèi)做出預防與治療方案，減少養(yǎng)殖場的經(jīng)濟損失。試驗結果對該養(yǎng)殖場雞沙門氏菌的臨床防控與治療具有指導作用。