陳天剛 胡永芳

【摘要】目的：建立流式細胞術(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌藥敏試驗的方法。方法：利用結(jié)核分枝桿菌水解HDA的特點，選取HDA作為帶有熒光的材料。應(yīng)用流式細胞術(shù)檢測20株結(jié)核分枝桿菌對RFP，INH，SM和EMB的敏感性。MI值由不同濃度藥物影響細菌后培養(yǎng)物檢測到的平均熒光強度與陽性對照的比值來推斷[1]：20株結(jié)核分枝桿菌的流式細胞儀藥敏試驗結(jié)果與比例法基本一致。結(jié)論：建立流式細胞術(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌藥敏具有快速、準確、簡便等優(yōu)點，可用于臨床結(jié)核分枝桿菌藥敏的檢測。

【關(guān)鍵詞】結(jié)核分枝桿菌;微生物敏感性試驗;流式細胞術(shù)

【中圖分類號】R378.911【文獻標志碼】A【文章編號】1005-0019（2019）02-056-01

結(jié)核病是一種嚴重危害人類健康的傳染病。近年來，世界上結(jié)核病的發(fā)病率明顯增加，中國也不例外。在結(jié)核病控制過程中，結(jié)核分枝桿菌的耐藥性，尤其是耐多藥結(jié)核分枝桿菌的耐藥性，已成為結(jié)核病預(yù)防工作的嚴重障礙。耐多藥結(jié)核分枝桿菌（MDR-TB）與非標準臨床治療密切相關(guān)，需要快速、靈敏的藥物檢測方法。建立結(jié)核分枝桿菌快速藥敏試驗是有效控制結(jié)核病的重要方法。目前，比例法已廣泛應(yīng)用于國內(nèi)各實驗室進行分枝桿菌的藥敏試驗。這種方法在分離菌株后獲得藥敏試驗結(jié)果需要四周的時間。在二十世紀八十年代建立的BACTECTB 460分枝桿菌檢測系統(tǒng)基礎(chǔ)上開發(fā)的BACIECMG TI960可縮短獲得藥敏試驗結(jié)果的時間到5-8天，但存在要求特殊儀器、試劑比較昂貴、有一定的污染率等缺點。近年來，隨著流式細胞儀器在醫(yī)院中的普及，流式細胞術(shù)在細菌藥敏試驗中的應(yīng)用得到了很大的發(fā)展。細菌與熒光染料的結(jié)合程度可判斷細菌的活性?？焖偎幬锩舾行栽囼灳哂兄匾饬x。應(yīng)用流式細胞術(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌藥敏試驗已取得一定進展。然而，中國卻沒有媒體報道這一點[2]我們對此進行了研究。研究過程和結(jié)果如下：

1材料

1.1 菌株 結(jié)核分枝桿菌H37Rv標準株，以及于2018年1月至2018年2月在重慶市公共衛(wèi)生醫(yī)療救治中心分枝桿菌實驗室采集到的臨床分離株，鑒定出20株結(jié)核分枝桿菌，其中10株為耐多藥結(jié)核分枝桿菌（MDR-TB）。

1.2試劑? 利福平、異煙肼、鏈霉素、乙胺丁醇、乙酰乙酸熒光素和IMSQ均購自Signa，7H9液體培養(yǎng)基購自美國BD公司。FDA溶于DMSO，配置為1g/L的溶液，儲存在-20C。

1.3儀器? 流式細胞儀為BD FACSCalibur型號，是美國BD公司制造的。

2方法

2.1 標準菌株的藥敏試驗? 在羅氏培養(yǎng)基上挑取H37Rv標準菌株的菌落，在含有玻璃珠的無菌瓶中磨成干酪樣品。用生理鹽水制備1g/L菌懸液。將1 g/L菌懸浮液稀釋至10-2 g/L細菌提取物Q1MI，接種到含有不同濃度藥物的7H9液體培養(yǎng)基中。INH的最終濃度為1.25、2.5、5、10、20mg/L，RFP為1.25、2.5、5、10、20mg/L，SM為2、4、8、16、32mg/L，EMB為0.625、1.25、2.5、5、10mg/L，7 H9培養(yǎng)基為空白對照。然后將8%多聚甲醛添加到FDA37℃培養(yǎng)30min，用流式細胞術(shù)來確定最終和平均熒光強度。

2.2臨床菌株的藥敏試驗? 根據(jù)標準菌株藥敏試驗，篩選出檢測臨床菌株的最佳實驗方案。將20株臨床分離的結(jié)核分枝桿菌接種于含不同藥物濃度的7H9液體培養(yǎng)基中，最終INH濃度為2.5、5、10mg/L，RFP為5、10、20mg/L，SM為8、16、32mg/L，EMB為1.25、2.5、5 mg/L，在37℃培養(yǎng)72h，分別加入終濃度為250Lg/L的FDA 37℃孵育30min， 加入8%多聚甲醛處理40min，用流式細胞儀測定細菌的平均熒光強度。

2.3流式細胞儀檢測? 首先，利用熒光微球?qū)x器的光路和液體流動系統(tǒng)進行標定，確保儀器各項指標均在允許范圍內(nèi)，并將前角（FSC）和側(cè)角（SSC）的信號值設(shè)定為對數(shù)a。美化。根據(jù)FSC/SSC的信號調(diào)節(jié)電壓，以發(fā)現(xiàn)最集中的細菌。通過直方圖計算FDA在FL通道上的平均熒光強度（MF I），最低抑菌濃度（MIC）。通過比較藥物管與不含藥物的陽性對照管的MF的60%或更多來確定。

2.4比例法檢測結(jié)核分枝桿菌的藥敏試驗? 參照《結(jié)核病診斷實驗室檢驗規(guī)程》91操作。

2.5統(tǒng)計分析? 使用? SPS91.0統(tǒng)計軟件進行分析，配對資料采用X2檢驗，RQ05為差異有統(tǒng)計學意義。

3結(jié)果

流式細胞術(shù)檢測不同時間的對照結(jié)果，可以看出培養(yǎng)時間為72個小時最為適宜，在流式細胞術(shù)檢測臨床株的藥敏試驗結(jié)果與絕對濃度法結(jié)果比較上，我們可以發(fā)現(xiàn)通過這兩種方法檢測的結(jié)果沒有差別。

4討論

FDA是一種無極性、無熒光酯，本身不發(fā)熒光，滲入活細胞后，可被胞質(zhì)中的酯酶迅速水解釋放出熒光素，在488mm的藍光激發(fā)下，發(fā)射出黃綠色的熒光，可經(jīng)流式細胞儀檢測。? 利用FDA的特點，使之與結(jié)核分枝桿菌作用，該物質(zhì)能穿透活的分枝桿菌細胞壁并能被胞質(zhì)中的非特異性酯酶迅速水解為游離的熒光素，而死菌和被抗結(jié)核藥物抑制的細菌因缺乏活性酯酶而不能有效地水解FDA游離熒光素產(chǎn)生會相應(yīng)減少，通過流式細胞儀檢測帶熒光的分枝桿菌的熒光強度的變化來推斷MIC獲得藥敏試驗結(jié)果[3]首先建立了結(jié)核分枝桿菌標準菌株H37R的流式藥敏試驗方法，藥物和細菌作用后我們可以得到結(jié)果，結(jié)果和狀態(tài)或與樣品的處理有關(guān)。在試驗過程中為防止實驗室污染，保證操作者的安全，上樣前對樣品用8%的多聚甲醛處理，使結(jié)核桿菌失活，但發(fā)現(xiàn)甲醛的處理后會使部分試驗管的熒光強度有所降低，在一定程度上影響了試驗結(jié)果，這一問題還有待解決。

5結(jié)語

結(jié)核分枝桿菌細胞學敏感性試驗簡便、快速、靈敏、重復(fù)性好。如果它被發(fā)展成一套成熟的方法，它可以作為一個常規(guī)的臨床試驗來執(zhí)行。因此，結(jié)核分枝桿菌藥物敏感性實驗的快速檢測，從28天到2-3天，一方面有利于結(jié)核病的治療，另一方面也能及時發(fā)現(xiàn)耐多藥結(jié)核患者，減少結(jié)核患者的傳播。

參考文獻

[1]李慶炎.翟志敏.流式細胞術(shù)用于念珠菌快速藥敏試驗的研究[J]中國臨床保健雜志201 10（2） 1227-1229.

[2]馬筱玲，李志敏.流式細胞術(shù)檢測抗生素最低抑菌濃度[J]中華微生物學和免疫學雜志，2016（4）3639-3645.

[3]夏曉華，泉.流式細胞術(shù)應(yīng)用于金黃色葡萄球菌體外藥敏試驗的初步研究[J]中國人獸共患病雜志，20164）5053-5058.