肖懷文

【摘要】目的：探討CK20信息RNA及CK20蛋白在結(jié)直腸癌患者中的表達(dá)及與預(yù)后的相關(guān)性。方法：選擇2016年6月-2018年4月手術(shù)治療結(jié)直腸癌患者60例作為對(duì)象，設(shè)為觀察組，術(shù)中取病灶組織及癌旁組織（距離腫瘤≥5cm）;另選正常結(jié)直腸組織46例，設(shè)為對(duì)照組。采用RT-PCR法測(cè)定不同組織CK20信息RNA水平;采用免疫組織化學(xué)法測(cè)定各組CK20蛋白表達(dá)水平;統(tǒng)計(jì)并記錄觀察組年齡、性別、腫瘤直徑、腫瘤分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、預(yù)后等資料，分析不同病理資料下CK20信息RNA及CK20蛋白表達(dá)水平并完成多因素Logistic分析。結(jié)果：觀察組癌旁組織與對(duì)照組CK20信息RNA及CK20蛋白陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;觀察組病灶組織CK20信息RNA及CK20蛋白陽(yáng)性率，均高于癌旁組織及對(duì)照組（P<0.05）;多因素Logistic分析結(jié)果表明：觀察組結(jié)直腸癌組織中CK20信息RNA及CK20蛋白陽(yáng)性率與性別、年齡、腫瘤部位無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;觀察組結(jié)直腸癌組織中CK20信息RNA及CK20蛋白陽(yáng)性率與腫瘤大小、分化程度、腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：CK20信息RNA及CK20蛋白在結(jié)直腸癌患者中呈高表達(dá)，能反映患者疾病嚴(yán)重程度，與預(yù)后存在相關(guān)性。

【關(guān)鍵詞】CK20信息RNA;CK20蛋白;結(jié)直腸癌;多因素Logistic分析;相關(guān)性

【中圖分類(lèi)號(hào)】R541.4【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A【文章編號(hào)】1005-0019（2019）02-017-01

結(jié)直腸癌均為臨床上常見(jiàn)的惡性腫瘤，發(fā)病早期臨床癥狀不典型，且隨著病情的不斷發(fā)展，多表現(xiàn)為排便習(xí)慣改變、便血、腹瀉、局部腹痛等，晚期可表現(xiàn)為貧血、體重減輕等，影響患者健康及生活[1]。臨床研究表明[2]：早期局限性CRC患者5年生存率超過(guò)90.0%，但是早期確診率低于40.0%，多數(shù)患者確診時(shí)已經(jīng)達(dá)到中、晚期，喪失最佳治療時(shí)機(jī)。CK20屬于細(xì)胞角蛋白家族成員之一，具有嚴(yán)格的上皮組織特性，且主要分布在胃、腸粘膜細(xì)胞及相應(yīng)的癌細(xì)胞中，但是在結(jié)直腸癌患者中的表達(dá)及與預(yù)后的相關(guān)性研究較少[3]。因此，本文采用隨機(jī)對(duì)照方法進(jìn)行研究，探討CK20信息RNA及CK20蛋白在結(jié)直腸癌患者中的表達(dá)及與預(yù)后的相關(guān)性，報(bào)道如下。

1資料與方法

1.1臨床資料

選擇2016年6月-2018年4月手術(shù)治療結(jié)直腸癌患者60例作為對(duì)象，設(shè)為觀察組，術(shù)中取病灶組織及癌旁組織（距離腫瘤≥5cm），男34例，女26例，年齡（39-73）歲，平均（56.81±4.69）歲;腫瘤大小（1-9）cm，平均（4.51±0.74）cm;分化程度：高分化23例，中分化20例，低分化17例;腫瘤分期：I-II期35例，III-IV期25例;腫瘤部位：結(jié)腸41例，直腸19例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：是16例，否44例。另選正常結(jié)直腸組織46例，設(shè)為對(duì)照組，男27例，女19例，年齡（40-74）歲，平均（57.07±4.73）歲，兩組臨床資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

1.2方法

（1）CK20信息RNA。采用RT-PCR法測(cè)定不同組織CK20信息RNA水平。分別取觀察組病灶組織、癌旁組織及對(duì)照組組織，經(jīng)PBS進(jìn)行沖洗后加入500uL trizol吹打，使得組織充分溶解，加入500uL trizol充分混合、均勻。將上述溶液放入體溫5min下使得蛋白體充分解體，加入0.2mL氯仿，劇烈震蕩15s，常溫下放置2-3min，15min離心，速度12000rpm，獲得三層液體（上層為水相、中間層與下層為有機(jī)相）。取RNA沉淀，轉(zhuǎn)移到新的EP管中，加入0.5mL異丙醇，充分混合后放置在-20℃冰箱中，10min離心，速度為12000rpm，可見(jiàn)凝膠狀沉淀（即為RNA）。充分洗滌RNA，并加入250uL DEPC與750uL乙醇，利用乙醇完成沉淀的沖洗，5min離心，速度為7400rpm，取沉淀放入工作臺(tái)上進(jìn)行20min干燥。利用紫外分光度儀檢測(cè)RNA濃度并完成RNA提純（以Rnase作為空白對(duì)照），在A260下測(cè)定吸光度值。采用Dnase酶處理RNA，處理完畢后放入冰箱中，備用。②PCR反應(yīng)。檢測(cè)CK20信息RNA表達(dá)量。CK20上游引物5'-GGCTCTCCAGAACATCAT-3';下游引物：5'-CACCTGGTGCTCAGTGTA -3'。β-actin 鼠抗人單克隆抗體。β-actin 上游引物5-GGCACACTCCAAGCGCTGAGAATG-3。β-actin 下游引物 5ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3設(shè)定反應(yīng)條件：30℃，10min;42℃，30 min;99℃，5 min;5℃，5 min，連續(xù)進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72℃下完成10min延長(zhǎng)。選擇獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物，放入1.5%瓊脂凝膠進(jìn)行電泳，完畢后采用UVP凝膠圖像完成灰度值的測(cè)定，β-actin為內(nèi)對(duì)照[4]。

（2）CK20蛋白表達(dá)水平。采用免疫組織化學(xué)法測(cè)定各組CK20蛋白表達(dá)水平。①檢測(cè)方法。分別取觀察組病灶組織、癌旁組織及對(duì)照組組織，加入蒸餾水與濃度為30.0%H2O2，常溫下加入內(nèi)源性酶并進(jìn)行10min滅火，PBS連續(xù)進(jìn)行3次洗滌。將最終獲得的切片放置在0.01M枸櫞酸鹽緩沖液中，加入生理鹽水控制溶液PH最終為6。電爐加熱直到煮沸，5min間隔后再次煮沸，常溫下冷卻。采用PBS2次洗滌，每次5min，最后加入5%BSA封閉液并加入加入兔抗人CK20蛋白抗體（1：100），兔抗人CK20蛋白一抗，一滴。滴加完畢后進(jìn)行3次PBS洗滌;在1mL底物中加入兔抗人CK20蛋白二抗一滴，混合后常溫下顯色，蘇木素復(fù)染后封片，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞數(shù)量，每份標(biāo)本測(cè)定三次，取平均值;②判斷方法。參考奧爾雷德評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)分別從細(xì)胞的陽(yáng)性數(shù)量（陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≤25.0%0分，26%-50.0%1分，51%-75%2分，>75%3分）、染色強(qiáng)度（不著色0分，黃色1分，棕黃色2分，黃褐色3分）完成免疫組化染色評(píng)分，總分16分，陽(yáng)性率越高[5]。（3）不同病理下CK20信息RNA及CK20蛋白表達(dá)水平。統(tǒng)計(jì)并記錄觀察組年齡、性別、腫瘤直徑、腫瘤分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、預(yù)后等資料，分析不同病理資料下CK20信息RNA及CK20蛋白表達(dá)水平并完成多因素Logistic分析。

1.4統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS18.0軟件處理，計(jì)數(shù)資料行χ2檢驗(yàn)，采用n（%）表示，計(jì)量資料行t檢驗(yàn)，采用（x±s）表示，P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1兩組CK20信息RNA及CK20蛋白陽(yáng)性率比較

觀察組癌旁組織與對(duì)照組CK20信息RNA及CK20蛋白陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;觀察組病灶組織CK20信息RNA及CK20蛋白陽(yáng)性率，均高于癌旁組織及對(duì)照組（P<0.05），見(jiàn)表1及圖1。

2.2觀察組不同病理下CK20信息RNA及CK20蛋白陽(yáng)性率比較

觀察組結(jié)直腸癌組織中CK20信息RNA及CK20蛋白陽(yáng)性率與性別、年齡、腫瘤部位無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;觀察組結(jié)直腸癌組織中CK20信息RNA及CK20蛋白陽(yáng)性率與腫瘤大小、分化程度、腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表2。

3討論

結(jié)直腸癌是臨床上常見(jiàn)的惡性腫瘤，發(fā)病早期臨床癥狀缺乏典型性，多數(shù)患者確診時(shí)已經(jīng)是中晚期，喪失了最佳治療時(shí)機(jī)[6]。臨床研究表明[7]：腫瘤細(xì)胞微轉(zhuǎn)移是腫瘤轉(zhuǎn)移的重要途徑，亦是患者手術(shù)失敗的重要原因。微轉(zhuǎn)移發(fā)展為臨床轉(zhuǎn)移過(guò)程主要是微量腫瘤細(xì)胞從原發(fā)病灶脫離，逃避機(jī)體免疫監(jiān)控，侵襲正常組織，存活并增殖，從而引起腫瘤生長(zhǎng)。因此，微轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)歸取決于細(xì)胞的生物學(xué)特性、機(jī)體的免疫狀態(tài)及宿主器官的微環(huán)境。CK起源于上皮細(xì)胞，是上皮細(xì)胞骨架的重要組成部分，可以分為酸性CK與堿性CK兩種，多表達(dá)與正常上皮、上皮源性原發(fā)及轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞中，是上皮分化最為可靠的標(biāo)記物[8]。本研究中，觀察組病灶組織CK20信息RNA及CK20蛋白陽(yáng)性率，均高于癌旁組織及對(duì)照組（P<0.05），說(shuō)明CK20信息RNA及CK20蛋白在結(jié)直腸癌患者中呈高表達(dá)，能直接參與疾病的發(fā)生、發(fā)展。臨床研究表明：CK系列是檢測(cè)循環(huán)癌細(xì)胞的敏感標(biāo)記物，且CK19與CK20最為廣泛。CK20屬于堿性CK，含有8個(gè)外顯子、7個(gè)內(nèi)含子，主要局限在胃腸上皮細(xì)胞中，且在正常的血液、骨髓、淋巴結(jié)中均無(wú)表達(dá)，具有高度的敏感性、特異度，表達(dá)水平相對(duì)穩(wěn)定，是判斷結(jié)直腸癌是否發(fā)生微轉(zhuǎn)移的重要參數(shù)。因此，臨床上加強(qiáng)結(jié)直腸癌患者CK20信息RNA及CK20蛋白表達(dá)能反映患者疾病嚴(yán)重程度，有助于評(píng)估患者預(yù)后，指導(dǎo)臨床治療。

綜上所述，CK20信息RNA及CK20蛋白在結(jié)直腸癌患者中呈高表達(dá)，能反映患者疾病嚴(yán)重程度，與預(yù)后存在相關(guān)性。

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