盧麗斯， 黃秒， 孫克儉， 覃世興， 王莉雯， 馮祥， 匡琪琪， 葛盈盈， 王弘， 姚家麗， 付駿， 吳圣明， 胡啟平△

廣西醫(yī)科大學(xué) 1臨床醫(yī)學(xué)系,基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院, 3細(xì)胞生物學(xué)與遺傳學(xué)教研室, 4組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室(廣西南寧 530021); 廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 2影像學(xué)診斷中心, 5病理科(廣西南寧 530021)

原發(fā)性肝癌(primary liver cancer，PLC)是肝細(xì)胞或肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞發(fā)生的惡性腫瘤，原發(fā)性肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)為其最常見的組織類型之一，亦是全球最常見的惡性腫瘤之一。2017年我國(guó)國(guó)家癌癥中心發(fā)布的最新數(shù)據(jù)顯示，2013年全國(guó)各大中小城市肝癌發(fā)病率為28.17/10萬，新發(fā)病例63 800例，在所有惡性腫瘤中排名第三；死亡率24.70/10萬，僅次于肺癌排名第二[1-3]。HCC發(fā)生于肝細(xì)胞，分化程度差異大，具有預(yù)后差、術(shù)后復(fù)發(fā)率高、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移多見、5年生存率較低等特征。在廣西地區(qū)，HCC也被公認(rèn)為是高發(fā)且死亡率最高的惡性腫瘤之一。金屬硫蛋白(metallothionein，MT)中的MT-1，包括MT-1A、MT-1E、MT-1F等。有研究表明金屬硫MT-1在多種惡性腫瘤(肺癌、肝癌、胃癌等)的表達(dá)與腫瘤的發(fā)展和愈后有密切關(guān)系。眾多學(xué)者研究顯示，MT-1在肝癌細(xì)胞中表達(dá)顯著降低，但其具體機(jī)制尚不十分清楚[4-6]。在Lu等[7]的研究中，MT-1F 被認(rèn)為是一個(gè)潛在的腫瘤抑制基因，能抑制肝癌細(xì)胞 HepG2 的生長(zhǎng)。癌-睪丸抗原(cancer testis antigen, CTA)是一類可在多種腫瘤組織中表達(dá)而在睪丸以外的其他正常組織中幾乎不表達(dá)的抗原，是近期腫瘤抗原研究領(lǐng)域的一大熱點(diǎn)。CT23又稱OY-TES-1，是CTA家族中的一員，2001年由Ono等[8]首次報(bào)道。目前研究表明，CT23在HCC中有較高的表達(dá)頻率及表達(dá)水平, 該蛋白具有較強(qiáng)的免疫原性, 有望作為用于HCC輔助診斷及免疫治療的腫瘤抗原[9-10]。現(xiàn)有研究提示，HCC的發(fā)生、發(fā)展可能與MT-1表達(dá)下調(diào)和CT23高表達(dá)有關(guān)。而MT-1和CT23兩種蛋白在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中是否存在相關(guān)性尚未可知，目前國(guó)內(nèi)外亦無聯(lián)合探究MT-1和CT23與HCC發(fā)生發(fā)展的關(guān)系及相關(guān)臨床意義的報(bào)道。因此，本研究運(yùn)用RNA干擾(RNA interfering，RNAi)、表達(dá)譜芯片分析、熒光定量PCR、免疫組化SP法檢測(cè)CT23與MT-1在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)關(guān)系、CT23與MT-1在癌組織與癌旁組織表達(dá)的差異以及與患者臨床資料的相關(guān)性和意義，旨在了解MT-1和CT23 在HCC發(fā)生、發(fā)展中的聯(lián)系，為進(jìn)一步研究HCC的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制和相應(yīng)治療措施提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 共62例HCC(HCC組)及癌旁組織(癌旁組)，標(biāo)本均取自廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院普外科2015—2016年行手術(shù)治療的HCC患者，所有病例均經(jīng)病理證實(shí)。其中男55例，女7例，<60歲49例，≥60歲13例；Edmondson分級(jí)Ⅰ～Ⅱ級(jí)28例，Ⅲ～Ⅳ級(jí)30例，未能分級(jí)4例；有轉(zhuǎn)移15例，無轉(zhuǎn)移44例，3例無法判斷。多發(fā)腫瘤29例，單發(fā)腫瘤37例；腫瘤最大徑≥5 cm 43例，<5 cm 19例；乙肝表面抗原(HBsAg)陽性53例，陰性9例；甲胎蛋白(AFP)陽性42例；伴有肝硬化23例；伴肝細(xì)胞脂肪變性10例。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料 人HCC 細(xì)胞系Bel-7404購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞所，用含10%胎牛血清(Gibco)的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。62例HCC癌組織及癌旁組織取自廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院普外科行手術(shù)治療的HCC患者，并經(jīng)患者本人同意使用于本研究。

1.3 CT23 RNA干擾和表達(dá)譜芯片分析 針對(duì)CT23的siRNA序列制備和siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染按Fu等[11]的方法進(jìn)行。簡(jiǎn)而言之，Bel-7404細(xì)胞培養(yǎng)于24孔板，當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)到約50%時(shí)，以siRNA∶轉(zhuǎn)染試劑=1 μg∶5 μL 的比例進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染。細(xì)胞分別于轉(zhuǎn)染24、48、72 h后收獲。轉(zhuǎn)染CT23特異性siRNA的組記為si.CT23組，未處理組記為Untreated組，轉(zhuǎn)染試劑處理組記為MOCK組，無關(guān)序列siRNA處理組記為si.Ctrl組。轉(zhuǎn)染后的Bel-7404細(xì)胞總RNA用Trizol試劑制備后用安捷倫的Human 1A基因芯片(V2)(安捷倫科技有限公司，上海，中國(guó))分析CT23下調(diào)后的基因表達(dá)情況。CT23 RNA干擾后興趣基因的表達(dá)驗(yàn)證用熒光定量PCR進(jìn)行[12]。

1.4 免疫組化SP法 HCC組織和癌旁組織置于10% 甲醛溶液固定，經(jīng)脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋后 4 μm厚連續(xù)切片，進(jìn)行免疫組織化學(xué)法染色。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組織化學(xué)SP法試劑盒(北京中杉公司)。檢測(cè)操作步驟如下：石蠟切片烘干，水化，加入0.1 mol/L枸櫞酸溶液高壓修復(fù)10 min；3%H2O2去離子水孵育5～10 min，PBS沖洗3 min×3次；滴加正常山羊血清工作液室溫孵育10～15 min，去除廢液；滴加一抗(小鼠抗人metallothionein 單克隆抗體，abcam公司；兔抗人CT23單克隆抗體[13]，廣西醫(yī)科大學(xué)組織與胚胎學(xué)教研室制備)，4℃孵育過夜；過夜后PBS沖洗3 min×3次；滴加生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG，37℃孵育10～15 min，PBS沖洗3 min×3次；滴加S-A/HRP，37℃孵育10～15 min，PBS沖洗3 min×3次；使用DAB顯色，蘇木素復(fù)染，封片。陰性對(duì)照使用PBS溶液替代一抗溶液。染色結(jié)果采用組織化學(xué)評(píng)分法(H-score)[14]進(jìn)行評(píng)分。H-score=Σpi(i+1)，式中pi表示陽性細(xì)胞數(shù)量占切片中所有細(xì)胞數(shù)量的百分?jǐn)?shù)；i代表著色強(qiáng)度。MT-1和CT23的陽性染色標(biāo)準(zhǔn)為細(xì)胞質(zhì)或膜、核上有黃染部分。陽性細(xì)胞百分比：任意觀察5個(gè)高倍視野得出陽性細(xì)胞數(shù)量占切片中所有細(xì)胞數(shù)量的百分?jǐn)?shù)。染色強(qiáng)度分為5級(jí)，分別是無顯色：0分；淺黃染：1分；較淺黃染：2分；中等黃染：3分；深黃染：4分；棕褐色：5分。評(píng)分過程由2 位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)師采用雙盲原則共同閱片、計(jì)分。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)應(yīng)用Excel進(jìn)行整理、用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。組間表達(dá)差異采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，MT-1和CT23表達(dá)與臨床資料的相關(guān)性分析采用兩配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，MT-1與CT23表達(dá)關(guān)系采用Pearson相關(guān)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝癌細(xì)胞中CT23與MT-1的表達(dá)關(guān)系 下調(diào)CT23后的Bel-7404細(xì)胞的基因表達(dá)譜顯示，與si.Ctrl組比較，si.CT23組中8個(gè)MT-1基因表達(dá)全部上調(diào)，且差異表達(dá)都在3倍以上，其中MT-1F表達(dá)上調(diào)最明顯，達(dá)到31倍左右(表1)。選取差異表達(dá)最明顯的MT-1F和MT-1E用熒光定量PCR進(jìn)一步證實(shí)，Bel-7404細(xì)胞中CT23下調(diào)后MT-1表達(dá)是明顯上調(diào)(圖1)。

基因si.Ctrl?si.CT23倍數(shù)改變(Si.CT23/Si.Ctrl)P值MT-1F3.46±0.088.42±0.1431.55<0.05MT-1E12.78±0.0114.88±0.085.33<0.05MT-1G13.30±0.1015.20±0.054.22<0.05MT-1B13.82±0.0715.71±0.063.72<0.05MT-1A14.00±0.0315.86±0.043.64<0.05MT-1H13.96±0.0315.77±0.043.52<0.05MT-1X7.19±0.608.98±0.073.52<0.05MT-1L13.35±0.0815.10±0.043.34<0.05

*表達(dá)值的自然對(duì)數(shù)值

*與si.Ctrl組比較P<0.05

圖1熒光定量PCR驗(yàn)證Bel-7404細(xì)胞中CT23下調(diào)后MT-1F和MT-1E的mRNA表達(dá)

2.2 MT-1和CT23在HCC組織及癌旁組織中的分布 MT-1和CT23的陽性信號(hào)主要定位于細(xì)胞質(zhì)，部分細(xì)胞胞膜、細(xì)胞核也有少量分布，光學(xué)顯微鏡下呈棕黃色或棕褐色顆?；驁F(tuán)塊狀(圖2)。

2.3 MT-1和CT23在HCC組織及癌旁組織中的表達(dá) HCC組織中MT-1和CT23的表達(dá)均較癌旁組織低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2和表2。

組織例數(shù)MT-1(n=47)CT23(n=49)HCC組織62149.47±9.73?133.47±10.11?癌旁組織62269.02±19.35191.22±6.89

*與癌旁組織比較P<0.05

2.4 HCC組織及癌旁組織中MT-1和CT23表達(dá)與臨床資料間的關(guān)系

2.4.1 MT-1表達(dá) 在HCC組織中，Edmondson分級(jí)越低，MT-1的陽性表達(dá)評(píng)分越高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；并且，腫瘤數(shù)目為單發(fā)的HCC組織中MT-1陽性表達(dá)評(píng)分高于腫瘤多發(fā)的HCC組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。MT-1在HCC組織中與年齡、性別、HBsAg、腫瘤大小、AFP、肝硬化、肝脂肪變性、有無轉(zhuǎn)移無明顯關(guān)系(P>0.05)。在癌旁組織中，MT-1與年齡、性別、HBsAg陽性、腫瘤大小、Edmondson分級(jí)、AFP、肝硬化、肝脂肪變性、有無轉(zhuǎn)移、腫瘤數(shù)目等均無明顯關(guān)系(P>0.05)。見表3。

圖2 MT-1和CT23在癌旁組織及HCC組織中的表達(dá)(免疫組化，×100)

2.4.2 CT23表達(dá) 在HCC組織和癌旁組織中，CT23蛋白的陽性表達(dá)與年齡、性別、HBsAg、腫瘤大小、Edmondson分級(jí)、AFP、肝硬化、肝脂肪變性、有無轉(zhuǎn)移、腫瘤數(shù)目等均無明顯關(guān)系(P>0.05)。見表3。

2.5 MT-1與CT23表達(dá)之間的關(guān)系 在癌旁組織中，MT-1與CT23之間的表達(dá)無明顯關(guān)系(P>0.05)，見表4。在HCC組織中，MT-1與CT23之間的表達(dá)可能存在相關(guān)性，P值接近0.05。

3 討論

MT是一類低相對(duì)分子質(zhì)量、高金屬含量、富含半胱氨酸、功能獨(dú)特的小分子胞質(zhì)結(jié)合蛋白，在人體肝臟內(nèi)含量最多。國(guó)內(nèi)外眾多學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，MT在肝癌細(xì)胞中表達(dá)顯著降低，但其具體機(jī)制尚不十分清楚[4-5]。易石堅(jiān)等[15]研究發(fā)現(xiàn)肝癌中MT表達(dá)低，且病理分化越差者的表達(dá)更加明顯下降，提示MT可能抑制肝癌的發(fā)生發(fā)展。根據(jù)MT所帶電荷性質(zhì)的差異, 其家族可分為MT-1、MT-2、MT-3和MT-4四類異構(gòu)體。在Tao等[16]對(duì)肝癌組織及對(duì)應(yīng)的非癌性肝組織標(biāo)本的研究中，顯示MT-1在肝癌組織中的表達(dá)下降，Park等[16-19]經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)MT-1/2在肝癌細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)明顯低于正常的肝細(xì)胞。Ono等[8]發(fā)現(xiàn)人類CT23基因以來,國(guó)內(nèi)外對(duì)CT23與腫瘤間的聯(lián)系做了較多的研究，如卵巢癌、大腸癌、膠質(zhì)瘤、肝癌等，并證實(shí)CT23了腫瘤組織中CT23表達(dá)量與臨床資料存在相關(guān)性，提示CT23有望成為輔助診斷及免疫治療腫瘤的新抗原[12，20-24]。本課題組前期研究表明，下調(diào)HCC細(xì)胞株中CT23基因的表達(dá)可通過上調(diào)caspase-3和下調(diào)cyclin E來抑制HCC細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移，并減弱其侵襲力[11]；還可能通過影響NANOG、 CD9、CCND2和CDCA3的表達(dá)來調(diào)控癌細(xì)胞的惡性行為[25]，然而尚無研究表明肝癌組織中MT-1表達(dá)與CT23表達(dá)有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，HCC組織中MT-1的表達(dá)較相應(yīng)癌旁組織低(P<0.05)；Edmondson分級(jí)越低，MT-1的陽性表達(dá)評(píng)分越高(P<0.05)；腫瘤數(shù)目為單發(fā)的HCC組織中MT-1陽性表達(dá)評(píng)分高于腫瘤多發(fā)的HCC組織。MT-1是肝臟參與解毒的物質(zhì)基礎(chǔ)之一，所含硫基可與鎘等親電性金屬、自由基以及某些細(xì)胞代謝物等結(jié)合，從而參與重金屬解毒、自由基清除以及應(yīng)激反應(yīng)。哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)自發(fā)性基因突變最重要的原因是內(nèi)源氧化損傷，MT-1表達(dá)的下降可導(dǎo)致氧自由基的堆積，從而引起某些原癌基因的激活或抑癌基因的失活。有研究[26]提出鎘能夠誘發(fā)產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化物、DNA損傷，還有研究表明MT-1的分泌減少使得癌細(xì)胞進(jìn)一步增殖和轉(zhuǎn)移[15]。由此推斷MT-1表達(dá)減少M(fèi)T-1，引起肝組織對(duì)重金屬解毒及清除自由基能力下降， 自由基和重金屬的共同作用導(dǎo)致肝臟功能受損和細(xì)胞癌變及轉(zhuǎn)移，是癌組織分級(jí)升高、腫瘤多發(fā)的原因之一。Tao等[16]研究發(fā)現(xiàn)，HCC組織與非癌組織相比MT表達(dá)顯著下調(diào)，HBsAg 與MTs 表達(dá)下調(diào)有關(guān)。本研究中未發(fā)現(xiàn)HCC組織中MT-1的減少與HBsAg有關(guān)，可能由于本研究樣本數(shù)較少所致，具體原因仍有待進(jìn)一步研究驗(yàn)證。綜合上述，MT-1的表達(dá)與HCC的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。

臨床資料MT-1CT23例數(shù)HCC組織P值例數(shù)癌旁組織P值例數(shù)HCC組織P值例數(shù)癌旁組織P值性別0.9280.781?0.741?0.184 男41149.88±77.2747275.40±91.0844132.27±73.3947199.57±91.03 女6146.67±106.336286.67±108.575144.00±87.645142.00±89.55年齡0.7220.952?0.957?0.623 ≤60歲36151.81±81.5242276.29±97.2838133.16±74.3342190.96±91.62 >60歲11141.82±78.7211278.18±72.9111134.55±76.4710207.00±95.46HBsAg0.7810.547?0.327?0.315 陽性39151.41±80.5545273.42±92.6240128.50±74.7243188.14±92.38 陰性8140.00±82.818295.00±93.049155.56±70.559222.22±87.43腫瘤最大徑0.9140.469?0.504?0.235 <5 cm16151.25±87.3214292.14±100.3216143.75±77.0213167.69±89.27 ≥5 cm31148.55±77.6739271.13±89.7133128.48±73.1939202.82±91.85Edmondson分級(jí)0.0350.325?0.758?0.852 Ⅰ～Ⅱ級(jí)20164.00±81.2022290.18±86.1621134.76±74.5422189.55±80.62 Ⅲ～Ⅳ級(jí)25127.40±69.6628263.57±99.5624127.92±73.0126154.52±98.03AFP0.0750.356?0.209?0.778 陽性34136.62±73.0437284.43±97.1934120.59±69.5935196.57±99.59 陰性13183.08±90.8716258.75±79.0715162.67±77.7817188.92±75.16肝硬化0.4640.145?0.435?0.352 無28142.32±79.9732261.69±99.9321140.71±74.9331203.87±84.05 有19160.00±81.3821299.52±75.3328123.81±73.4521179.52±96.53轉(zhuǎn)移0.7000.762?0.913?0.057 無29146.38±77.5637274.05±94.1233134.24±72.8536208.61±82.23 有16156.25±88.9113264.92±89.5513131.54±79.5713155.38±89.50肝脂肪變性0.8650.330?0.813?0.800 無40147.63±80.9346271.83±94.2243134.42±72.8446159.22±93.26 有7152.29±81.427308.57±74.716126.67±89.146185.00±85.26腫瘤數(shù)目0.0470.169?0.899?0.209 單發(fā)25162.40±84.5230292.00±78.6725134.80±76.0028208.93±85.52 多發(fā)22134.77±74.0123256.70±105.6324132.08±73.4824176.67±97.21

組織表達(dá)評(píng)分MT-1CT23Pearson相關(guān)系數(shù)P值HCC組織150.57±80.335128.18±71.9910.2880.058癌旁組織278.71±93.294192.04±94.0050.2130.134

本研究結(jié)果顯示，在HCC組織中CT23蛋白表達(dá)量較相應(yīng)的癌旁組織少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與年齡、性別、癌癥分期等臨床資料無相關(guān)性。但是范蓉等[10]研究發(fā)現(xiàn)，在37對(duì)HCC組織及配對(duì)癌旁組織中, HCC組織中CT23 mRNA水平明顯高于對(duì)應(yīng)的癌旁組織, 其差異與病理分級(jí)有關(guān)(P<0.05)，與本研究結(jié)果中蛋白表達(dá)水平相反，此外HCC組織中CT23蛋白陽性率僅為40%。綜合兩項(xiàng)研究推測(cè)，肝癌細(xì)胞中CT23表達(dá)過程中可能存在mRNA轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控和蛋白合成后的修飾，mRNA水平與蛋白水平間的聯(lián)系并不十分緊密[27]。此外，CT23表達(dá)與原發(fā)性肝癌臨床資料的相關(guān)性存疑，存在此差異的具體原因，有待進(jìn)一步分析研究。

本研究中RNAi實(shí)驗(yàn)顯示，肝癌細(xì)胞中CT23下調(diào)后MT-1表達(dá)上升，由此結(jié)合MT-1的功能可推測(cè)CT23下調(diào)后肝癌細(xì)胞惡性行為的下調(diào)可能還通過MT-1表達(dá)上調(diào)來實(shí)行。本研究試圖在HCC組織和癌旁組織中分析蛋白水平上CT23和MT-1表達(dá)的關(guān)系時(shí)，發(fā)現(xiàn)兩者的蛋白表達(dá)在HCC組織中也有一定的相關(guān)性，其P值為0.058，可能為研究病例不足所致。因此該結(jié)果是否是肝癌發(fā)生、發(fā)展過程中CT23與MT-1關(guān)系的真實(shí)反映，尚需更多病例進(jìn)行研究。

綜上所述，MT-1在HCC組織中表達(dá)較癌旁組織中為低，且在Edmondson分級(jí)較高、腫瘤多發(fā)者中MT-1表達(dá)較低，可見MT-1與HCC的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，其機(jī)制可能與肝組織中MT-1下調(diào)后金屬解毒能力下降、自由基堆積導(dǎo)致細(xì)胞進(jìn)一步惡化相關(guān)。CT23下調(diào)后細(xì)胞中MT-1表達(dá)上升，CT23下調(diào)后肝癌細(xì)胞惡性行為的下調(diào)可能通過MT-1表達(dá)上調(diào)來實(shí)現(xiàn)，在HCC組織及癌旁組織中MT-1與CT23的表達(dá)也具有一定相關(guān)性， 提示MT-1與CT23在HCC的發(fā)生、發(fā)展中相關(guān)，但其具體機(jī)制尚不明確，有待進(jìn)一步研究。